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【摘要】 [目的]研究Ⅱ型胶原海绵的材料特性与其在修复软骨缺损中的作用。[方法]对比Ⅱ型胶原海绵与Ⅱ型胶原膜的力学、孔径方面等材料特性的差异，并建立兔膝关节软骨缺损模型，A组接受Ⅱ型胶原海绵移植，B组接受Ⅱ型胶原膜移植，而C组为空白对照组，术后不予治疗，分别于2、6和12周取材，通过组织学染色观察软骨缺损处修复的效果。[结果]Ⅱ型胶原海绵与Ⅱ型胶原膜在材料特性上有显著差异，胶原自发荧光分层扫描通过图像分析得出A组平均孔径为(93.26±38.41) μm，弹性模量(0.098±0.0 017) MP/m2，均较B组更为理想。组织学显示A组6周时生成大量新生软骨，12周时新生软骨形态与成熟度已经接近正常，较B、C两组更为优越。[结论]Ⅱ型胶原海绵有理想的孔径和合理的生物力学结构性质，有利于软骨缺损的修复，是一种具有良好材料特性的组织工程基质。
【关键词】 组织工程; Ⅱ型胶原; 生物力学; 孔径; 软骨缺损
Experimental study of material characteristics of collagen typeⅡ and its repairing efficacy to cartilage defect∥LIAO Ying-yang , CHEN Hong-hui,YANG Xiao-hong，et al.Traumatology Insitute of Guangzhou, The 4th Affiliated Hospital of Medical College of Jinan University, Guangzhou 510220, China
Abstract: To study the material characteristics of collagen typeⅡ and its efficacy in repairing cartilage defect. Differences in material characteristics such as mechanism,pore-diameter between the two kinds of materials were compared.The cartilage defect model of rabbit knee joint were constructed.In group A,cartilage defects was repaired by spongy-collagen type Ⅱ.In group B,by membrane-collagen type Ⅱ while group C received no treatment.In 2,6,12 weeks postoperatively,the specimens were sacrificed and repair effects were observed with histological staining method.Significant differences had been found between the two kinds of material. In group A ,the mean diameter was (93.26±38.41)μm and the mean modulus of elasticity was(0.098±0.0017) MP/m2,which were better than those in group B. In group A,6 weeks postoperatively, a great deal of neogenetic cartilage was observed and in 12 weeks postoperatively, the shape and maturity of neogenetic cartilage were observed close to normal level in group A, which had advantages over those in group B、C.Spongy-collegan type Ⅱ has fairly rational biomechanics performances and proved to have significant efficacy in cartilage defect. To conclude ,it is a kind of tissue-engineering matrix with good material characteristics.
Key words：tissue-engineering; collagen type Ⅱ; biomechanics; pore diameter; cartilage defect
近年来,大量的文献[1、2]资料显示,胶原产品越来越广泛地被应用于组织工程与相关临床研究。而材料成型工艺、材料特性对修复软骨疗效有着显著影响[3～6]，因此,本文以改进方法提取纯化Ⅱ型胶原，并且以两种不同的成型方法分别制成Ⅱ型胶原膜与Ⅱ型胶原海绵，通过比较力学性能、孔径大小，结合动物实验病理分析结果，探讨两种Ⅱ型胶原制品在材料特性与修复兔膝关节软骨缺损方面的优劣。
1 主要仪器与试剂
盐酸胍、胃蛋白酶、苏木素、伊红-Y、Safranin’O、Fast Green等均购自Sigma公司;激光共聚焦显微镜(LSM 510 META)、荧光显微镜(Zeiss Asiovert 200M)、显微图像分析系统(Axio Vision Rel. 4.5 Software)均购自ZEISS公司;拉力测试机(H25K-S)(拉力测试机自带软件QMAT Professional material testing software)均购自Tinus Olsen公司。
2 实验方法
2.1 Ⅱ型胶原的制备 从新鲜屠宰的猪关节中切取透明软骨，脱脂、捣碎、制匀浆，然后分别用4 M 的盐酸胍去除蛋白多糖、再用胃蛋白酶酶解，氯化钠盐析后用醋酸溶解，调至中性，冷冻干燥。
2.2 Ⅱ型胶原材料的成型方法
2.2.1 以上经过分离提纯的Ⅱ型胶原溶液调节好pH值后，过滤除菌，倒入模具，使用冷冻干燥机把经过提纯后的Ⅱ型胶原冻干成海绵状，制成Ⅱ型胶原海绵，Co60放射线消毒后备用。
2.2.2 以上经过分离提纯的Ⅱ型胶原溶液调节好pH值后，过滤除菌，倒入模具自然风干，制成Ⅱ型胶原膜，Co60放射线消毒后备用。
2.3 两种材料孔径的测试
以激光共聚焦显微镜对Ⅱ型胶原基质海绵与Ⅱ型胶原生物膜分别进行胶原自发荧光分层扫描，激发波长为488 nm，发射波长为520 nm，以自发荧光信号强度为限，Ⅱ型胶原基质海绵扫描厚度为136.64 μm，Ⅱ型胶原-透明质酸复合膜扫描厚度为212.43 μm;使用CLSM图像分析系统进行操作和分析，并对两种材料的孔径进行测量。然后以SPSS 13.0软件包对数据结果进行Independent-Samples T Test统计分析。
2.4 两种材料力学特性比较
以拉力测试机分别对Ⅱ型胶原基质海绵与Ⅱ型胶原生物膜以100 mm/min的速度进行单轴拉伸力学测试，材料断裂时终止力学测试，使用拉力测试机自带软件测定这两种材料的极限抗张强度、最大应变、拉伸率、最大负荷、弹性模量等指标;并分别绘制这些材料的负荷-拉伸曲线和应力-应变曲线，分析材料的力学性能。最后以SPSS 13.0软件包对数据结果进行Independent-Samples T Test统计分析。
2.5 动物实验
2.5.1 动物实验分组将27只新西兰成年纯种雄兔随机分为3组：A组Ⅱ型胶原海绵组，B组Ⅱ型胶原生物膜组，C组空白对照组，每组9只。术后分别于2、6和12周，3个时间点取材。每组每个时间点处死3只动物做病理分析。
2.5.2 动物实验方法
手术兔用6 g/L 的戊巴比妥钠2.6 mg/kg 经耳缘静脉麻醉后，无菌操作下行膝关节内侧长约4 cm的纵切口，依次切开皮肤，筋膜，关节囊，到达关节腔，将髌骨导向外侧脱位，暴露出股骨滑车部。在股骨内髁滑车面用电动钻，先用直径2 mm的钻头初步定位，钻出小凹陷，然后换5 mm钻头在此基础上钻出直径5 mm、深3 mm 的全层关节软骨缺损区，软骨下骨板被完全破坏，用生理盐水冲洗清除组织碎屑和血块后暴露缺损。分别使用两种材料填充缺损，然后两组皆以生理盐水冲洗后，以将髌骨复位，分层缝合膝关节囊、组织和皮肤。术后不固定膝关节，使用青霉素5万IU/kg预防感染。分笼饲养，在笼内自由活动。
2.6 病理分析方法
2.6.1 HE染色 按照常规HE染色方法
2.6.2 Safranin’O-Fast Green染色方法
二甲苯，梯度酒精脱蜡至水，0.1%Fast Green染2 min，1%乙酸分色10秒，然后0.1%Safranin’O染6min,蒸馏水洗，梯度酒精脱水、二甲苯透明和中性树胶封固。
2.6.3 Safranin ’O面积测定方法
使用ZEISS,Axio Vision 4.5显微图像分析系统，将显微镜下拍摄的染色的图像导入软件，然后在软件中选择测量工具，将染色的红色和粉红色部分用软件勾画出来测量这个区域的面积，将一张图片中的所有区域的面积相加求得总面积(图1)。以SPSS 13.0软件包对数据结果进行Independent-Samples T Test统计分析。
图1用计算机软件勾划新生软骨区域，然后统计面积
3 结果
3.1 两种材料孔径与力学性能分析结果比较(表1)
以SPSS软件将表1中四项数据均进行独立样本t-test数据分析，得出P<0.05，两种材料比较有显著统计学意义。表1 两种材料孔径与力学性能分析结果比较
3.2 病理分析
3.2.1 HE染色观察(图2)
术后2周：空白组缺损内有大量肉芽组织填充，间质内大量新生毛细血管及炎症细胞浸润;Ⅱ型胶原膜组缺损区存在大量填充材料，损伤界面有大量肉芽组织形成及炎细胞浸润;Ⅱ型胶原海绵缺损区已由大片新生骨组织和类软骨组织填平，表层可见较完整的软骨层，软骨及软骨下骨之间分界清楚，有明显的潮线形成;缺损区下骨髓腔内仍有大量未降解的材料，并有纤维母细胞、骨细胞及类软骨细胞向材料中长入。术后6周：Ⅱ型胶原海绵组缺损内填充物大部被吸收，大量新生软骨生成，表面仍有毛糙，可见明显潮线，而Ⅱ型胶原膜组缺损内填充物仍较多未被吸收降解，软骨生成少，未见明显潮线形成;空白对照组缺损表面有孤立、不延续新生软骨区域形成。术后12周：Ⅱ型胶原膜组缺损区填充物大部被吸收，新生软骨量较前多，有潮线形成但仍呈断续不延续状，而Ⅱ型胶原海绵组软骨表面平滑，潮线完整，空白对照组新生软骨较前为多，部分融合，但是潮线仍不完整。
3.2.1.1 H.E Wakitani评分[19](表2)
3.3.2 Safranin’O-Fast Green染色(图3)
术后2周，3个组别均以绿染组织为主，Ⅱ型胶原膜组缺损边缘有少量红染的类软骨组织从残端处长入;Ⅱ型胶原海绵组表层可见粉红色的类软骨组织覆盖于移植材料之上。术后6周，3个组别的软骨细胞增生较先前较活跃，Ⅱ型胶原膜组的新生软骨相对较少。Ⅱ型胶原海绵组缺损区表层新生软骨组织完整，但基质染色较浅，与正常红染的组织比较仍然有较大差别。在空白对照组，新生软骨面积介于上述两组之间。术后12周,3个组的新生软骨组织相似，缺损区边缘新生软骨组织与周围正常软骨组织融合生长，基质的染色、细胞形态及排列与周围正常组织差异不大。
表2 H.EWakitani评分(n±s-)术后2周(n=9)术后6周(n=9)术后12周(n=9)空白对照组10.33±0.587.67±0.586.33±0.58Ⅱ型胶原膜组11.67±0.589.00±1.006.67±0.58Ⅱ型胶原海绵7.67±0.586.33±0.586.00±1.00P值00.0130.579F值37.339.60.6 图2术后2～6周组织学切片图(HE×50) 图2a空白对照组 图2bⅡ型胶原海绵组术后2周 图2cⅡ型胶原膜组术后2周
图2d空白对照组术后2周 图2eⅡ型胶原海绵组术后6周，箭头所示为新生软骨 图2fⅡ型胶原膜组术后6周 图3术后2～6周组织学切片图(Safranin O×50)，对照图1样本相同区域的特殊染色，其中软骨细胞及软骨基质染成红色，其余组织为绿色 图3a空白对照组术后2周 图3bⅡ型胶原海绵组术后2周 图3cⅡ型胶原膜组术后2周 图3d空白对照组术后6周 图3eⅡ型胶原海绵组术后6周，箭头所示为新生软骨 图3fⅡ型胶原膜组术后6周,箭头所示为新生软骨组织爬行至缺损区3.3.2.1 Safranin’O-Fast Green染色软骨面积计算与均数直条图(见表3)
以SPSS 13.0软件包对3个组2周、6周Safranin O面积作one–way ANOVA Bonferrnoni检验。结果2周各组面积F=54.36，P=0，有显著统计学差异，6周各组间F=7.85,P=0.021，有显著统计学差异。
4 讨论
Ⅱ型胶原作为人类软骨组织中的主要成分，有良好的生物相容性、生物力学特性，在众多胶原材料中，促进软骨修复的效能最好。但由于Ⅱ型胶原提取、纯化工艺较为复杂[10]，以往类似研究多采用Ⅰ型胶原作为基质材料。所以改进方法提取、纯化的Ⅱ型胶原有良好的组织、细胞相容性，而且较国外主流同类产品有更高的纯度[8～10]。D. Green等[11] 研究表明软骨组织工程支架材料的孔径在90～120 μm范围内的时候，最适合于诱导软骨生长。在本研究中，我们以激光共聚焦显微镜配合专用软件测得，Ⅱ型胶原海绵组平均孔径为(93.26±38.41) μm，Ⅱ型胶原膜组为(204.64±83.75) μm，无疑前者的平均孔径远较后者更加接近于最适于软骨生长的孔径。从两种材料的拉力测试效果来看，Ⅱ型胶原海绵的极限扩张强度低于Ⅱ型胶原膜，但是在其最大应变、极限拉伸度方面高于Ⅱ型胶原膜，而弹性模量更是远小于后者，说明Ⅱ型胶原海绵的可塑性比Ⅱ型胶原膜强。在动物实验过程中，作者体会到，Ⅱ型胶原海绵容易塑形，易于固定在软骨下钻孔后的缺损中。而Ⅱ型胶原膜则容易折断、碎裂，易于在孔道里脱出。因此，Ⅱ型胶原海绵较Ⅱ型胶原膜具有更理想的力学特性。
表3 Safranin’O-Fast Green染色软骨面积计算统计表(n±s-)2周(μm2)6周(μm2)空白对照组257 649.0±40 092.6400 003.0±93 498.6Ⅱ型胶原膜组125 586.3±125 586.3219 754.3±40 747.7Ⅱ型胶原海绵369 225.7±19 048.5370 641±96 274.5P值00.021F值54.367.85
关于骨关节损伤修复的组织工程基质的降解性能的测定，目前主要采用3种方法：体外测定、皮下种植、关节内种植。体外测定的降解过程并不能真实反映材料在体内的降解速率[20];而体内种植同样无法模拟关节腔的生理学、力学内环境;而关节内种植，直接将支架材料置于关节受区，避免了前两种方法的缺点，受到越来越广泛的采用[21]。本研究从HE染色结果可观察到：术后2周，接受两种不同材料种植的软骨缺损处均有大量未被吸收降解的材料。术后6周，Ⅱ型胶原膜组缺损处骨髓腔内有大量填充材料仍然未能降解，呈致密状，未见纤维母细胞等间质细胞长入材料空隙处;而Ⅱ型胶原海绵组缺损处骨髓腔内填充材料大部分被吸收，在残留的少部分未降解的Ⅱ型胶原材料中，发现有大量纤维母细胞长入材料中(图1e)。病理结果客观反映了一个过程：Ⅱ型胶原海绵能在修复初期起到一个提供表面新生软骨爬行、以及使骨髓间充质细胞沿孔隙长入的支架作用，幷在新生软骨及软骨下骨塑形的阶段，大部分被降解吸收;相对比下，Ⅱ型胶原膜则过于致密，不利于新生组织爬行及细胞长入，而且降解太慢，阻碍了新生组织的生长、爬行替代作用。
止血、限制炎症的功能一直被普遍认为是生物材料的一种重要的特性[12～14]。软骨修复过程中，如出血量过多，则加剧炎症反应。而积血凝块将机化而成大量的纤维组织，一定程度上阻碍了软骨细胞的爬行生长。杨、武等[15、16]在动物实验研究中发现，Ⅱ型胶原海绵有良好的止血与限制炎症的作用。胶原海绵一旦与出血创面接触,其接触面迅速形成凝胶而粘附在出血创面上,外面则形成连续的压迫干层,建立一种理想的止血状态与结构。另外,形成的持续时间较长的稳定凝胶,可保证新生创面组织顺利地长入,从而达到创面修复的目的。而本次动物实验过程中，充分体会到：胶原海绵有良好的吸液、填塞作用，而胶原膜的坚硬易碎的质地，无法有效止血，因此，Ⅱ型胶原海绵组手术出血量远较Ⅱ型胶原膜组与空白组为少。
HE染色作为常规病理观察方法适合于观察组织的形态结构，与周围组织的序列关系。作者以细胞形态、基质染色、表面规则性及软骨厚度四方面的为评价标准，观察3个组的HE染色切片。2、6周3个组的Wakitani评分之间均有显著统计学差异，而到12周则无显著统计学差异(表2)。Safranin’O染色可以明确显示蛋白多糖中的糖氨多糖(GAG)的含量[17]，而糖氨多糖的含量则与类软骨细胞的活性密切相关。Safranin’O染色结果显示，2周软骨面积上Ⅱ型胶原海绵明显优于Ⅱ型胶原膜与空白组，而到6～12周，差距同样有缩小趋势(表3)，但在软骨成熟度上前者仍较后者有明显优势。而崔玉明等[18]在使用胶原海绵结合rhBMP-2对兔股骨髁面软骨缺损进行修复过程中发现在2、12及24周各时点，HE染色评分上实验组均较空白对照组有显著统计学差异，与我们观点相近。
本次实验通过比较生物力学、材料孔径、病理分析结果，说明Ⅱ型胶原海绵较Ⅱ型胶原膜有更加合理的生物学结构性质，更加有利于修复软骨缺损，是一种具有良好材料特性的生物工程基质。
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作者单位：广州市红十字会医院、广州市创伤外科研究所 510220