骨髓间充质干细胞向髓核细胞的转化

【摘要】  骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同环境下可诱导分化为多胚层来源的细胞，如：骨细胞、软骨细胞等。椎间盘退变主要源于髓核细胞及细胞外基质的变化，髓核细胞为类软骨细胞，随着细胞生物工程技术和分子生物学的进展，利用骨髓间充质干细胞结合细胞载体可再生出组织工程化的髓核细胞，将其植入椎间盘，从而阻止和逆转椎间盘退变，为治疗椎间盘退变提供一条新途径。

【关键词】  骨髓间充质干细胞; 椎间盘退变; 基因治疗; 组织工程学

Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into nucleus pulposus cells∥HAN Cheng-long, JIANG Chao.Department of Orthopaedics, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China

　　Abstract:Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) have the ability of multi-directional differentiation. In different environments, it can be induced into various blastodermic layer cells, such as osteoblast, chondrocyte and so on. Intervertebral disc degeneration (IDD) is mainly the change of nucleus pulposus cells and extracellular matrix. Nucleus pulposus cell is a chondrocyte-like cell. With the progress of cell bioengineering and molecular biology, the tissue engineering nucleus pulposus cells can be regenerated by BMSCs combined with cell carrier. It can be implanted into intervertebral disc to prevent and reverse IDD. It will be a new way for treating IDD.

　　Key words：bone marrow mesenchymal stem cells; intervertebral disc degeneration; gene therapy; tissue engineering

　　腰椎间盘退变发病率很高，并且产生了巨大的社会影响，一旦开始退变，则难以逆转，近年来对椎间盘退变的分子生物学发展机制进行了大量的研究，虽其确切的发病机制尚不清楚，但由于细胞因子减少和炎症因子增多，导致基质金属蛋白酶活性增加，细胞外基质降解加速，髓核进行性脱水，椎间盘细胞生存的内环境被破坏，出现了椎间盘退变，提出应用基因治疗和组织工程相结合的椎间盘再生治疗。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)，在体外适当的培养条件下可以向成软骨细胞转化[1]，而髓核细胞为类软骨细胞，利用组织工程学原理和方法将骨髓间充质干细胞与细胞载体复合植入椎间盘内，渴望再新生工程化的髓核细胞，从而为椎间盘的退变和治疗提供了一条新途径。

　　1 骨髓间充质干细胞分离和培养方法

　　1.1 BMSCs的分离方法

　　目前BMSCs的分离方法主要有4种：即密度梯度离心法、贴壁筛选法、流式细胞仪和免疫磁珠法[2]：(1)密度梯度离心法：其机制是根据MSC与其他细胞的密度不同而将它分离出来;虽然密度梯度离心法比贴壁筛选法复杂，但纯度高;(2)贴壁筛选法：根据MSC在培养瓶中贴壁生长的特性，将该细胞与其他类型的细胞进行分离;贴壁筛选法具有操作简便，费用低廉，效果切实可靠的优点;(3)流式细胞仪分离法和免疫磁珠法是根据细胞大小不同和细胞表面的一些特殊标志，用特异性抗体结合磁性进行细胞分选，但是这两种方法对细胞活性有一定的影响，而且分离出来的细胞数目少，费用昂贵，不利于大量推广使用。骨髓中BMSCs的含量很低，要利用BMSCs就必须实现BMSCs的体外分离培养和扩增。因此，如何从贴壁的异质细胞群中分离得到较为纯化的BMSCs具有十分重要的意义。

　　1.2 BMSCs的三维培养方法

　　该培养方式中，支架材料不仅为细胞提供三维的结构支架，使细胞间形成适宜的空间分布和细胞连接;通过多种成分的合成材料和天然材料加工成不同的结构和形状，用于BMSCs三维培养，构建骨、软骨等。(1)高密度细胞团块培养：细胞团中的细胞处于高密度环境，增强了细胞之间的连接，类似于软骨组织发生过程中的前软骨组织，因此有助于BMSCs向软骨的分化和软骨细胞表型的维持[3]。(2)微囊化培养：将细胞包裹于生物材料制成的选择性半透膜中即可形成微囊。微囊为细胞提供了微生态环境，氧、营养物质、电解质、分泌产物等小分子物质可以自由地通过，进行物质交换。利用藻酸盐微球包被骨髓间充质干细胞进行软骨细胞方向的定向诱导逐渐开展[4]。(3)微载体培养：微载体是由葡聚糖、明胶、胶原等材料制成的直径介于40～120 μm的微珠，将其悬浮于细胞培养液中，细胞即可在其表面贴附、伸展和增殖。Sikavitsas[5]采用动态和静态的三维培养体系比较，发现动态三维可降解材料上老鼠的BMSCs，在增殖分化和三维细胞培养体系能够有效地种植功能细胞、保持旺盛的细胞活性、最大程度地发挥细胞的功能，为BMSCs的体外培养提供了一种全新模式。

　　1.3 低氧状态下的培养 Risbud等[6]模拟椎间盘低氧环境，对BMSC向髓核样细胞分化进行了研究。作者在藻酸盐支架中三维培养大鼠BMSC，培养液中添加TGF-β进行诱导，分别在低氧(2%O2)和正常环境下培养，采用流式细胞仪、半定量逆转录PCR和Western blot等方法来检测。结果表明在低氧条件下，分化后的干细胞在基因水平和蛋白水平都表达了髓核细胞在椎间盘内的低氧反应产物以及髓核细胞分泌的细胞外基质，表达的量高于在正常氧含量环境中分化的干细胞;他认为在低氧条件下,BMSC可以向具有髓核样细胞分子表型的细胞分化。

　　1.4 极低密度传代培养 Javazon等[7]对极低密度下人与鼠MSC的培养进行对比研究，结果表明：后者对极低密度传代培养更敏感。大多数实验室认为高密度传代培养细胞生长缓慢，通常的解释是培养过程中细胞与细胞间的接触抑制，但是否由于培养的细胞在培养过程中分泌的某种物质导致这一结果，尚在进一步的探索之中。

　　1.5 微重力培养 运用旋转培养仪(rotating cell culture system,RCCS)模拟微重力的培养环境，组织细胞处于稳定的流体悬浮状态，流体动力抵消了重力沉降现象，细胞生长受到持续低剪切力刺激，且不断改变方向的重力向量可能直接影响基因表达，或者间接促进细胞的自分泌/旁分泌，有利于细胞间的信号传递，从而提高细胞分化质量[8]。

　　2 骨髓间充质干细胞诱导分化髓核细胞

　　2.1 BMSC转化髓核的体内实验研究

　　赵梓汝等[9]将在转化生长因子(transforming growth factor beta，TGF-β1)干预下兔BMSCs与透明质酸钠植入兔退变椎间盘的模型中，分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白聚糖含量的变化;免疫组化法测定Ⅱ型胶原的含量变化。结果原代培养及传代培养显示兔骨髓间充质干细胞具有活跃的增殖倍增能力，并且8周内蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的含量实验组比模型组增高明显，从而延缓椎间盘退变。II型胶原能诱导并维持间充质干细胞向软骨细胞分化，还能与转化生长因子β1相互作用增强骨髓间充质干细胞的分化能力[10]，其他生长因子如骨形态发生蛋白2、4、7(BMPs-2、4、7)，成纤维细胞生长因子等，对椎间盘细胞外基质合成的直接或间接促进作用也相继得到证实[11]，Sakai等[12]将BMSCs在家兔退变椎间盘模型制成2周后，分别移植入L2、3、L4及L4、5椎间盘,24周后检查正常椎间盘。模拟手术椎间盘和移植后椎间盘的X线片椎间盘高度MRI T2信号的改变，组织学、免疫组织化学和基质关联的基因表达。

　　结果显示移植BMSCs组椎间盘的高度为正常对照组的81%，免疫组织化学和基因表达分析有蛋白聚糖积聚，认为BMSCs移植对退变家兔椎间盘的再生有效，对于退变的椎间盘疾病是一个有价值的治疗方法。

　　2.2 BMSC转化髓核的体外实验研究

　　体外实验诱导干细胞分化的最常见方法是使用细胞因子刺激。Steck等[13]采用三维培养BMSC，用TGF-β1刺激，成功诱导BMSC向软骨样细胞分化。使用cDNA-array技术检测相关的45个基因发现，将分化后的干细胞基因表达特征与软骨细胞和椎间盘细胞比较，其更接近椎间盘细胞。Visage等[14]研究证实，BMSCs与纤维环细胞共同培养能表达出较高的糖氨聚糖，即BMSCs与纤维环细胞共同培养可以提高蛋白聚糖的合成。Richardson等[15]用人椎间盘髓核细胞与BMSC接触共培养。培养7 d后用实时PCR的方法测定，在BMSC中蛋白聚糖和胶原的基因表达(椎间盘组织中的主要细胞外基质)类似髓核细胞，认为髓核细胞可以诱导BMSC向髓核细胞分化。

　　2.3 BMSC转化髓核的转基因实验研究

　　Richardson等[16]研究了转基因方法诱导BMSC分化。他们以腺病毒介导向BMSC转染SOX-9基因(SOX-9)是一种转录因子，与干细胞向软骨细胞分化有关并且可能保持软骨细胞的表型，椎间盘组织中也有表达，分别在平面贴壁培养和聚乳酸复合物三维培养，通过实时PCR和Western blot检测，显示蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达明显高于对照组，被认为向髓核细胞发生了分化。Nishida等[17]研究了超声介导基因转染技术的转染效率及远期效果，取得了可喜的成果，这一技术显著提高了转染效率，并且大鼠体内转染基因的表达持续了24周之久。这成果也为基因治疗的临床应用开辟了更为广阔的前景。随着在这一领域研究的不断深入。基因治疗完全有可能延缓或逆转椎间盘退变。从而从根本上减轻这类患者的痛苦。

　　2.4 相关支架的组织工程研究

　　在BMSC治疗椎间盘退变的研究中，理想的支架材料应该类似椎间盘基质成分，能够模拟体内椎间盘环境，具有生物相容性、生物降解性、三维立体多孔结构和一定的力学特性。表面微结构等参数可以预先设计和控制，容易通过铸模、挤压盐析、分相等技术加工成各种形状。目前研究的主要种类有α聚酯类，以聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、共聚物(PLGA)为主要代表，及聚丁酸、聚氨酯与聚酸酐等。为了寻找使用方便的支架材料，有学者研究了对温度敏感的复合物，壳聚糖结合羟基丁基，常温下该复合物为凝胶状，而低于常温时为液态，便于注射使用。Revell等[18]制作2种可注射的透明质酸衍生物HYAFF 120和HYADD3作为细胞支架，将自体骨髓MSC植入并培养3周，然后注射到已摘除髓核的猪腰椎间盘退变模型的原髓核部位，结果发现6周后仅行髓核摘除的对照组椎间隙变窄，纤维组织增生，软骨终板破裂，而注射HYAFF 120和HYADD3的椎间盘无明显退变征象，注入组织呈正常形态，且合成细胞外基质，表明HYAFF 120和HYADD3能形成髓核样组织，并具有良好的髓核生物力学特性。

　　3 展望

　　椎间盘退行性变，是困扰医学界的难题，而干细胞的研究成果为其治疗提供了更多的方法和途径，但骨髓间充质干细胞移植进入临床实验面临很多问题，如何快速获取更高纯度的骨髓间充质干细胞，如何避免或减少在体外扩增过程中细胞的自然分化，通过何种移植方法进入体内可以获得更高更好的治疗效果，如何增加移植细胞成活率，以及移植细胞的致瘤性等，尚待进一步研究。

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作者单位：(哈尔滨医科大学附属第一医院骨科，哈尔滨 150001)