间充质干细胞在软骨组织工程中的应用

【摘要】  ：间充质干细胞具有高度自我更新能力，能够分化为各种类型的细胞。近20年间充质细胞在软骨组织工程中得到应用，动物实验显示了良好的软骨修复潜能，成为软骨组织工程的理想的细胞来源。组织工程和干细胞技术已经确定为对软骨缺损有效的治疗方法，间充质干细胞有望在软骨组织工程中得到更广泛的应用。本文对间充质干细胞的特性和在组织工程中的应用进行了综述。

【关键词】  间充质干细胞　骨性关节炎　组织工程　自体软骨细胞移植术

　　Application of mesenchymal stem cells in cartilage tissue engineering

　　XU Hongsheng,LIU Jinzhao.

　　Department of Joint Surgery,the Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China

　　Abstract：Mesenchymal stem cells has an extensive proliferative potential and an ability to differentiate into various cell types.In recent years,masenchymal stem cells have  been applied in cartilage  tissue engineering and they have shown significant potenital for carriage repair  in  animal models,and are being used as an ideal cell source in cartilage tissue engineering.Tissue engineering and stem cell technologies have established themselves as approved approaches for cartilage repair and eventually will be widely used  in the clinical practive.This paper discusses the characteristics and the application of mesenchymal stem cells in cartilage tissue engineering.

    　Key words：mesenchymal stem cells;  osteoarthritis;  tissue engineering;   autologous chondrocyte transplantation

　　由于关节软骨的修复能力有限，软骨缺损的治疗存在巨大挑战。自体软骨细胞移植术(autologous chondrocyte transplantation)是软骨组织工程中的一种方法，目前治疗软骨缺损比较有效。软骨组织工程最常应用软骨细胞，由于存在供区并发症、软骨细胞的去分化和生命周期有限等问题，近20年间充质干细胞在结缔组织工程中得到应用，成为理想的细胞来源。间充质细胞已经在动物模型中显示了良好的软骨修复潜能。

　　1  自体软骨细胞移植术
   
　　修复软骨缺损有效的方法是自体软骨细胞移植术(ACT)。这种手术方法于20世纪80年代由瑞典学者报道，用于治疗骨性关节炎。应用ACT治疗的病人在全世界已经超过20 000例。  Peterson等［1］随访3～9年的结果显示病人的疼痛明显减轻，切取的12个活检标本中有8个显示透明软骨特征，关节软骨修复达到持久的修复效果，如果2年后植入物不失败，在3～8年的生存率接近100％。
       
　　第2代自体软骨细胞移植术应用生物材料膜(例如双层Ⅰ型胶原／Ⅲ型胶原膜)代替骨膜瓣以固定填充缺损部位的软骨细胞。目的是减少与使用骨膜瓣相关的骨膜反应例如骨膜肥大。第3代软骨细胞移植术是将软骨细胞在三维支架环境中培养，构建成新的软骨样的组织后再移植修复软骨。
       
　　应用ACT面临的主要问题包括供区部位的并发症，软骨细胞在体外扩增的去分化导致植入体内后不能形成软骨，纤维软骨修复以及机械性能较差，关节的修复部位整合不良等［2］。

 　   2  间充质干细胞与组织工程
       
　　成功的组织工程包括3部份：（1）能够提供合适的三维环境的支架；（2）能够分化和保持特殊细胞表型的细胞；（3）添加合适的生物活性物质如生长因子、细胞因子，作为细胞特异分化的合适的刺激。
        软骨组织工程面临的主要问题是获得有活力的和分化良好的软骨细胞。间充质干细胞有软骨分化潜能，容易在体外大量获取并扩增而不丢失分化能力，是软骨再生的理想细胞来源。

　　2.1  间充质干细胞的来源、分离和特性
       
　　间充质干细胞来源于中胚层，具有高度自我更新能力，与造血干细胞不同，能够分化为各种类型的细胞，包括骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞，肌细胞，心肌细胞和神经元。它在保持骨髓的动态平衡和调节造血细胞系和非造血细胞系的成熟方面起着重要作用，广泛存在于全身结缔组织和器官间质中。从骨髓，脐带血，脂肪组织和外周血中能够分离出间充质干细胞。间充质干细胞占骨髓中有核细胞总数的2%～3％，容易从骨髓中分离出来，在体外扩增几代而不丢失分化潜能［3］。间充质干细胞的主要特征是在体外条件下贴附在塑料上，体外培养扩增呈成纤维细胞形态，表达几种粘附分子，间充质干细胞存在的标记物包括CD105，CD  73，CD 90，不表达CD 45，CD 34和其他造血干细胞标记物［3,4］。脐带血是间充质干细胞的良好来源，脐带血来源的间充质干细胞能够分化为多种类型细胞，例如内皮细胞，神经元，平滑肌细胞，脂肪细胞，成软骨细胞和成骨细胞［5］。脂肪也是间充质干细胞的丰富来源［6］，脂肪来源的间充质干细胞在体外能够分化为不同系的细胞，包括脂肪系，软骨系，肌细胞系和成骨细胞系，与骨髓来源的间充质干细胞相比成软骨细胞的能力低［7］。Wagner等［8］应用含有22种细胞表面抗原标记物的仪器板的流式细胞计量术，发现从脂肪组织，脐带血和骨髓中分离出来的间充质干细胞的全部基因表达表型相同。用同样的方法培养的来源于不同供体的间充质干细胞产生持续的和可重复的基因表达。外周血分离出间充质干细胞数量很低，很难诱导分化为软骨细胞［9］。

　　2.2  间充质干细胞的诱导　

　　在体外间充质干细胞需要诱导才能分化为软骨细胞。这种诱导包括添加许多不同的生长因子，分化因子，激素和细胞因子。主要的有转化生长因子(TGF-β1，TGF-β3)，胰岛素样生长因子(IGF-1)，地塞米松，骨形态发生蛋白家族(BMPs)等。在软骨细胞的软骨分化过程中涉及激活的一个主要的信号传导通路是裂原活化蛋白激酶(MAPKinase)通路，它能够刺激形成特异性的软骨形成转录因子Sox9，在软骨细胞形成表型和功能方面起着重要作用。
   
　　间充质干细胞向软骨细胞分化过程中的细胞内的作用机制目前不是很清楚。Louise A［10］研究在单层塑料或3D胶原GAG支架中由TGF-β1和IGF-1诱发的信号传导通路，信号传导通路介导成体鼠来源的间充质干细胞向软骨分化。结果表明在单层培养和在胶原GAG支架中的TGF-β1诱导的软骨分化中包括p38途径，然而在单层培养中IGF-1诱导的软骨分化累及p38，ERKl／2和P13K。在IGF-1处理的间充质干细胞的细胞核内发现在P13K下游区的Akt(苏氨酸激酶)磷酸化和磷酸-Akt累积。表明不同生长因子诱导的间充质干细胞向软骨分化的信号传导通路不同，但同种生长因子在二、三维环境中刺激分化时细胞内的信号通路是相似的。
       
　　加入TGF-β1的诱导软骨分化可能通过smad3和β-蛋白(β-catenin)，以及Wnt信号通路来介导，提高间充质干细胞的分化能力，同时抑制成脂肪和成骨［11］。使细胞分化成为软骨系必须上调β-catenin，然而对于成熟的成人软骨细胞，β-catenin能够刺激软骨细胞肥大和骨化。Hansoo Parka等［13］研究一个可注射的生物可降解的水凝胶复合物聚L-醇延胡索酸(OPF)，包含兔骨髓间充质干细胞和明胶微粒，并带有TGF-β1。生物鉴定法显示DNA数量在各组间没有明显的不同，然而与对照组相比微粒组糖胺聚糖有明显的增加；软骨特异性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达明显增加并与TGF-β1浓度呈剂量依赖性改变。表明兔间充质干细胞在培养期是有活力的并分化为软骨样细胞。
       
　　Keun Hong Park等［12］将兔的间充质干细胞种植在混合的水凝胶中，加入TGF-β3或基本的成纤维细胞生长因子(bFGF)，判定生长因子对向软骨分化的效果。在含有TGF-β3的水凝胶支架内，检测全部的胶原和聚氨基葡糖含量最高，增殖率和产生软骨特异性的细胞外基质比bFGF组明显增高。这表明加有TGF-β3的细胞数量增加并保持细胞表型。
   
　　A.H.Huang等［14］确定负载软骨细胞和间充质干细胞的水凝胶构建物在化学培养基内培养加入TGF-β3时，能否达到正常的组织的抗张力性质，细胞负载琼脂糖水凝胶构建物作分光特性并在化学的无血清培养基内培养。细胞浓集且拉伸率提高并且保持在300～400 kPa的水平，最终的紧张度和韧性增加，通过免疫组织化学染色方法Ⅱ型胶原沉积明显增加。动物实验已经显示TGF-β 3能促进间充质干细胞向软骨分化［21,23］。
     
　　Lorenz U等［15］将人间充质干细胞种植在可控制的释放IGF-1丝纤蛋白(SF)支架内，将支架放在含TGF-β1补给性培养基内。在支架内第2周发现人间充质干细胞的软骨分化，第3周最明显，在不负载的控制组支架内没有观察到软骨分化。表明IGF-1在多孔SF支架内具有刺激人间充质干细胞向软骨分化的潜能。
      
　　地塞米松是一种合成的糖皮质激素，能够直接与糖皮质激素受体结合诱导软骨分化，是一种强有力的软骨分化的刺激物，并且能够加强TGF-β的作用［16］。
       
　　BMPs属于TGF-β超家族，能诱导软骨形成，尤其是BMP-7［17］，BMP-2、TGF-β联合应用或者BMP-6和TGF-β联合应用能够促进软骨分化。然而单独使用BMP-2诱导成骨细胞形成［17］。BMP-2、TGF-β合用通过Wnt信号传导通路上调Wnt3a、β-catenin，然后诱导产生Sox9和软骨形成。Hanna Taipaleenmki等［18］通过抑制造血细胞生长，分离贴附的老鼠来源的间充质干细胞，可以快速的去除CD34、CD45阳性表达细胞，以生产出短期选择(STS)细胞。进一步传代更富集的、更原始的、均一的Scal表达的长期的选择(LTS)细胞。应用几种BMP诱导微球培养的间充质干细胞向软骨细胞分化。在STS细胞，软骨分化进展很快，在STS细胞rhBMP2和7支持快速的软骨分化和终末分化，强于rhBMP6。在LTS细胞，rhBMP同源二聚体-2，-4，-6，和rhBMP异源二聚体2／7是有效的软骨分化的强化因子，强于rhBMP5，7。

　　2.3 构建组织工程软骨
       
　　间充质细胞已经与各种生物支架技术联合应用，在动物模型中显示了良好的软骨修复潜能。王文良等［19］以骨髓间充质干细胞为种子细胞，运用纤维蛋白胶种植技术，以双层壳聚糖(CS)／羟基磷灰石(HA)复合支架为载体，修复兔骨软骨缺损，结果显示基本修复软骨缺损，骨缺损有骨小梁长入，改良Wakitani评分优于对照组。S.Lken等［20］从11个新西兰大鼠的后侧髂嵴获取骨髓间充质干细胞，在自体血清中培养28 d并在移植前24 h转移至透明质烷支架内。在双侧膝关节的内侧髁制造4 mm直径和1.5 mm深的缺损，在一侧膝关节植入含有间充质干细胞的支架，对侧膝关节只植入支架。24周后处死兔子，组织学可以观察到缺损处高度的填充，两组间没有明显的不同，然而在间充质干细胞处理组有更好的修复质量的趋势，没有形成肥大细胞。Mrugala D等［21］从绵羊骨髓中分离间充质干细胞，扩增，并鉴定，在后腿的髌骨内侧制造部分厚度的软骨缺损，将间充质干细胞种植在壳聚糖内填充软骨缺损，并加入TGF-β3。在植入后2个月观察到修复部位透明样的软骨样基质包绕软骨样的细胞，并于周围软骨整合在一起。Bernd Wegener等［22］在成年羊的股骨髁负重部位制造关节软骨缺损(直径8 mm)，应用微骨折术治疗(n=6)，聚糖酯乳酸植入物治疗(n=6)或联合两者治疗(n=6)。12周后处死动物，检测缺损由再生组织覆盖的程度和用O’Driscoll评分检测再生的质量。结果显示联合治疗与单独使用微骨折术相比能够使再生物的质量明显提高。Seung Hwan Han等［23］应用间充质干细胞／PLGA(聚乳糖酯酸复合物)支架，在移植前经过TGF-β3处理3周，然后把复合物移植到兔的股软骨缺损处。在移植12周后，12只兔子中的10只显示间充质干细胞/PLGA支架复合物显示软骨再生。组织学检查为透明样的结构，表达糖胺聚糖和2型胶原。在统计学上组织学评分与正常的关节软骨相同，表明使用间充质干细胞/PLGA支架复合物并加入TGF-β3能够成功的再生关节软骨，治疗软骨缺损。

　　2.4  间充质干细胞在临床实验中应用
       
　　应用间充质干细胞治疗人关节软骨缺损的临床实验很少。Wakitani S等［24］对24例骨性关节炎病人进行临床实验。在这项研究中24个病人均接受胫骨高位截骨术，从12个病人的骨髓获取自体间充质干细胞，在单层培养中扩增并种植在Ⅰ型胶原膜上，植入软骨缺损部位，12个病人作为对照组，接受不带间充质干细胞的植入物。在移植后42周，缺损部位由白色软组织覆盖，在样本组织的几乎所有部位观察到甲苯胺蓝染色，局部观察到透明软骨样组织形成。虽然临床症状好转没有明显的不同，细胞移植治疗组与对照组相比，关节镜和组织学等级评分更高。Wakitani S等［25］获取病人自体骨髓间充质干细胞，体外自体血清培养扩增，将其种植在胶原凝胶内植入缺损部位，修复经关节镜证实的3个病人的髌股关节软骨全层缺损，并用自体骨膜或滑膜覆盖，在移植后6个月病人的症状明显改善，并且保持17～27个月。Kuroda R等［26］将自体间充质干细胞种植在胶原支架内，修复运动员的右膝内侧股骨髁的全层软骨缺损，植入物用自体的骨膜瓣覆盖，结果显示术后1年病人的临床症状明显改善，恢复到先前的运动水平，没有疼痛和其他合并症。以上表明自体骨髓间充质干细胞移植是促进软骨缺损修复的有效方法。

　　2.5  应用间充质干细胞构建组织工程软骨的困难
       
　　在软骨组织工程中应用间充质干细胞的主要障碍是构建的软骨组织不够成熟。在体外形成软骨过程中，间充质干细胞表达的透明软骨特异性标记物上调，Ⅱ型胶原和软骨特异性蛋白如蛋白聚糖，但是肥大软骨细胞的标记物如X型胶原和碱性磷酸酶也上调。45％的X型胶原由肥大软骨细胞产生，被认为是软骨内骨形成的一种重要的标记物。Steck E等［27］在迷你猪的膝关节制造软骨缺损，用胶原Ⅰ／Ⅲ膜覆盖，其中的一半接受自体间充质干细胞移植．在移植后8周，原位的环境触发空间的有结构的修复组织，上层纤维层，中间层软骨形成，下层为肥大的分化细胞，并有一个趋势更多的番红0和Ⅱ型胶原阳性的细胞。与体外间充质干细胞向软骨分化相比，体内分化COL10A1／COL2A1和MMP13／COL2A1的比率明显偏低。这表明与体外间充质干细胞向软骨细胞分化相比，体内的信号分子和生物力学刺激为祖细胞向胶原X阴性的软骨细胞分化提供一个合适的环境。这表明间充质干细胞在体外向软骨细胞分化可能是不成熟的。
       
　　成人正常的关节表面浅层和中区的软骨细胞碱性磷酸酶的活性很低，但碱性磷酸酶大量存在于钙化区的肥大软骨细胞内、软骨内骨化中心和生长板内，一般认为碱性磷酸酶是成骨的典型标记物。Hennig T等［28］将来源于脂肪组织的间充质干细胞(ATSC)球状培养向软骨细胞分化，结果显示软骨细胞显示X型胶原沉积和ALP酶活性上调。

   　 3  展 望
       
　　间充质干细胞可以从许多组织中得到，最合适的来源是骨髓，脐血和脂肪组织。与软骨细胞相比，它们的最大优点是在培养中有更高的增殖潜能，能够扩增得到组织工程软骨所需的细胞。对于软骨缺损的治疗，间充质干细胞是强有力的修复软骨的工具。组织工程和干细胞技术已经确定为有效的方法。需要深入研究间充质干细胞向软骨细胞分化的分化机制以及更详细准确的生物化学信号传导通路，以及间充质干细胞的生物学特性及其与三维支架的相互作用，以使分化的软骨细胞接近正常软骨细胞。这样有望进一步制造出修复关节软骨缺损的更合适的生物材料，最终成功的修复和再生软骨。

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作者单位：青岛大学医学院附属医院关节外科，青岛 266003