脂肪间充质干细胞向髓核样细胞诱导分化的初步研究

【摘要】  ［目的］定向诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为髓核样细胞，为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗奠定生物学基础。［方法］(1)200 g SD雄性大鼠断颈处死后，取腹股沟脂肪垫处脂肪，0.1%胶原酶消化，体外接种培养，同时采用极限稀释法纯化细胞；(2)利用流式细胞技术对细胞表面标记进行鉴定；(3)第3代细胞消化计数后，用1.2%海藻酸钠溶液悬浮，调整细胞密度至1×106/ml，滴入3.5%CaCl2溶液形成微球，加入含TGFbeta1的诱导培养基，低氧条件下进行微球联合培养；(4)7 d后，取部分微球进行Alcian Blue染色并收集微球内细胞提取RNA，进行RTPCR检测。［结果］(1)体外培养的脂肪间充质干细胞主要呈梭形和多角形，核大、核仁明显，平行排列生长或呈漩涡状生长；(2)流式细胞仪检测显示Sca1、CD44的阳性率分别为95.2%、99.7%，CD45、CD11b的阳性率分别为0.4%、1.5%；(3)微球联合培养7 d后，Alcian Blue染色表明，实验组细胞外基质的生成明显多于对照组；(4)RTPCR结果证实，髓核细胞标志基因和软骨细胞标志基因的表达，实验组明显高于对照组。［结论］(1)本实验方法可以获得大量均一的脂肪间充质干细胞；(2)脂肪间充质干细胞可以被定向诱导分化为髓核样细胞；(3)首次探讨了将脂肪间充质干细胞体外诱导后移植治疗椎间盘退变性疾病，为椎间盘退变性疾病的干细胞移植治疗提供了新的思路。

【关键词】  脂肪间充质干细胞　低氧　转化生长因子1　 髓核样细胞　大鼠

　　Differentiation of rat adipose tissuederived mesenchymal stem cells towards a nucleus pulposuslike phenotype in vitro

　　FANG Huang, XIE Liwei, CHEN Anmin, et al.

　　Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030,  China
   
　　Abstract：［Objective］To differentiate rat adipose tissuederived mesenchymal stem cells(ADSCs) into cells with a nucleus pulposuslike phenotype in vitro, so as to lay a foundation for the cellbased translantation  therapy of degenerated intervertebral discs.［Method］Rat ADSCs were isolated from the subcutaneous inguinal region, and purified using the method of limited dilution. The third passages were analyzed by fluorescence activated cell sorter(FASC) to examine the cell surface markers (Sca1, CD44, CD45 and CD11b). To induce ADSCs towards a nucleus pulposuslike phenotype, the author immobilized ADSCs in 3dimentional alginate hydrogels and cultured them in a inducing medium containing transforming growth factorbeta1(TGFbeta1) under hypoxia(2%O2), while control groups were under nomorxia (21% O2) in alginate beads in medium with or without TGFbeta1. Semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RTPCR) was carried out to evaluate expression of characteristic genes in the process of differentiation. Meanwhile, Alcian blue staining was used to detect the formation of sulfated glycosaminoglycans (GAG) by the differentiating cells.［Result］The purified ADSCs by limiteddilution appeared fibroblastlike shapes and proliferated rapidly in vitro. Results of flow cytometry showed that ADSCs were positive for Sca1 and CD44 and negative for CD45 and CD11b. The outcome of RTPCR manifested that the gene expression of Sox9, aggrecan and collagen type II, which were chondrocyte specific, were upregulated in medium containing transforming growth factorbeta1 under hypoxia (2%O2); likewise, gene expression of HIF1a, which was characteristic of intervertebral discs, was also upregulated. Simultaneously, Alcian blue staining exhibited the large formation of GAG. ［Conclusion］（1）The approach in this experiment proved to be a simple and effective way to acquire a large quantity of homogenous ADSCs. （2）Rat ADSCs can be differentiated into nucleus pulposuslike cells. （3）For the first time, this paper discussed the way of regenerating degenerated intervertebral discs using ADSCs by firstly differentiating them in vitro, thus providing a new way for cell transplantation therapy of degenerated intervertebral discs.

  　  Key words：adipose tissuederived mesenchymal stem cells;   hypoxia;  transforming growth factorbeta1;  nucleus pulposuslike cells;  rat

 　   椎间盘退变性疾病在临床上甚为常见，随着社会的老龄化，其发病率逐渐升高。现行的治疗包括保守治疗和手术治疗，或通过暂时降低椎间盘轴向载荷缓解症状，或通过去除退变椎间盘组织减压或稳定脊柱等手段进行处理，由于并未针对椎间盘退变的关键因素—退变所致的髓核细胞数量的减少及继发细胞外基质中蛋白聚糖的减少［1］，因此无法修复其结构。而干细胞移植治疗通过补充椎间盘内因退变所致的髓核细胞数量的减少，促进髓核细胞外基质的形成，修复退变椎间盘的结构，重建其功能，显示出良好的应用前景［2～4］。脂肪间充质干细胞，因其来源丰富，获取方便而组织损伤小，体外增殖迅速，免疫原性低，且同样具有向脂肪、骨、软骨、神经等组织多向分化的潜能，近年来备受关注［5］。本研究旨在分离、纯化、鉴定脂肪间充质干细胞的基础上，定向诱导其向髓核样细胞分化，为椎间盘退变性疾病的生物学治疗奠定基础。

  　  1  材料与方法

　　1.1  材料

    雄性SD大鼠（200 g）购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。混合型胶原酶（Sigma）、胰蛋白酶（Sigma）、DMEM/F12培养基（Hyclone）、DMEM/HG培养基（Hyclone）、胎牛血清（Hyclone）、总RNA提取试剂盒（TIANGEN）、引物（invitrogen）、RTPCR试剂（TOYOBO）、ITS liquid Media Supplement（100×）（Sigma）、Alcian Blue 8 GX（Sigma）、地塞米松（Sigma）、海藻酸钠（Sigma）、FITC标记抗体（Peprortech）、转化生长因子（R&D）。

　　1.2 方法

　　1.2.1  脂肪间充质干细胞的分离、极限稀释法纯化  　　

　　SD大鼠断颈处死后，仔细分离腹股沟脂肪垫处脂肪组织，尽量剔除筋膜组织及淋巴结。取脂肪组织1 cm3，PBS洗3遍，剪碎后2 000 r/min 离心10 min，保留上层脂肪组织，PBS重悬后2 000 r/min 离心10 min。上层脂肪组织加入4 ml 0.1%胶原酶溶液（用含10%FBS的DMEM/F12培养基配制），置于37℃ 5% CO2培养箱内消化2 h，每半小时摇匀一次。消化好的组织液1 500 r/min 离心5 min后弃上清，PBS重悬，1 500 r/min 离心5 min，弃上清。加入含有10%FBS、100 IU/100 ml青霉素、100 ug/100 ml链霉素的DMEM/F12培养基4 ml，接种于96孔板内。24 h后第1次换液，去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次。原代融合后，挑选成纤维样的梭形细胞克隆用0.25%胰蛋白酶溶液消化传代。

　　1.2.2  脂肪间充质干细胞的鉴定 

　　第3代细胞以0.25%胰蛋白酶溶液消化，用含血清培养基终止消化。计数后离心，弃上清，PBS重悬，使每个1.5 ml Eppendorf管内含有1×106个细胞；PBS洗涤2遍；室温下与FITC直接标记的抗体antirat Sca1（1:200）、antirat CD44（1:200）、antirat CD45（1:200）、antirat CD11b（1:200）孵育1 h；离心，弃上清；PBS洗涤两遍；加300 ul PBS，用流式细胞仪对细胞表面抗原Sca1、CD44、CD45、CD11b进行检测。

　　1.2.3  实验分组 

　　(1)对照组A：微球联合培养+普通培养基+21%O2；(2)对照组B：微球联合培养+诱导培养基+21%O2；(3)实验组C：微球联合培养+诱导培养基+2%O2。

　　1.2.4  培养基的配制 

　　普通培养基：DMEM/HG，10%FBS。诱导培养基：DMEM/HG，10%FBS，10 ng/ml转化生长因子（TGFβ1），100 nmol/L地塞米松，50 ug/ml抗坏血酸，100 ug/ml丙酮酸钠，40 ug/ml脯氨酸以及ITSpremix。

　　1.2.5  与海藻酸钠微球联合培养、诱导分化  　　

　　第3代细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，计数、离心，用1.2%海藻酸钠溶液进行重悬，调整细胞密度至1×106/ml。用22G注射器在3.5%CaCl2溶液液面上方2 cm处缓慢匀速滴下，室温下孵育10 min以形成直径2 mm的微球。PBS洗3遍。实验组加入诱导培养基，置于37℃ 2%O2的三相培养箱内培养。对照组分别加入诱导培养基和普通培养基置于37℃ 5%CO2培养箱内培养。每2 d换液一次。诱导7 d。7  d后，吸掉培养液，部分微球用于Alcian Blue染色；其余用55 mM柠檬酸钠溶液（用0.9%NaCl溶液配制）溶解，释放出微球内细胞。1 500 r/min离心5 min，弃上清；PBS重悬，1 500 r/min离心5 min，弃上清；细胞用于提取RNA。

　　1.2.6  Alcian Blue染色  　　

　　从诱导培养基组（B、C组）取部分微球用PBS洗3遍；室温下用Kalhes固定剂（6 ml 福尔马林，15 ml 95%乙醇，1 ml 冰醋酸, 80 ml 双蒸水）固定20 min；50%乙醇洗涤；70%乙醇洗涤；1% Alcian Blue 溶液（1 g Alcian Blue 8 GX, 100 ml 3% 醋酸溶液）固定30 min；双蒸水洗涤3遍；倒置显微镜下观察，数码相机拍照。

　　1.2.7  总RNA的提取 

　　每组微球内释放出的细胞，分别加入1 ml TRNzolA+，混匀后移入去除RNA酶的1.5 ml EP管，室温静置5 min；加入0.2 ml氯仿，充分混匀后室温静置3 min；12 000 r/min离心15 min，取上层水相400 ul至另一去除RNA酶的1.5 ml EP管；加入等体积异丙醇，室温放置10 min；12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入1  ml冰浴的75%乙醇洗涤沉淀（用DEPC处理水配制）；7 500 r/min离心5 min，弃上清；加10 ul DEPC处理水溶解沉淀；取2 ul稀释至200 ul，用分光光度仪测RNA浓度及纯度。

　　1.2.8  逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）  　　

　　采用两步法。RT步骤为：2 ul Oligo（dT） 引物，1～2 ug 总RNA，加DEPC处理水至12 ul；70℃ 5 min；4 ul 5×RT buffer，2 ul dNTP（10 mM），1 ul RNaes Inhibitor, 1 ul RT Ace；42℃ 1 h；95℃ 5 min。PCR步骤如下：5 ul 10×Taq Buffer, 0.5 ul dNTP（10 mM），0.5 ul上游引物（20 uM），0.5 ul下游引物（20 uM），2 ul cDNA，0.5 ul Taq polymerase，加ddH2O至25 ul；94℃ 5 min；94℃ 45s；55℃ 45s；72℃ 1 min；30个循环；72℃ 10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶，电压100 V，电流50  mI，电泳25 min。上样量均为5 ul。凝胶成像分析系统拍照分析（引物序列见表1）。表1  RTPCR各基因的引物序列GenesPrimersSize(略)

　　1.2.9  统计学分析
    　　
　　数据用均数±标准差表示，应用SPSS13.0软件，采用方差分析和LSDt检验进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。因软件功能限制，无具体t值。

　　2  结 果
　　
　　2.1  细胞培养结果

  　  极限稀释法获得的原代细胞在第10 d左右出现明显增殖，2周左右达到融合。细胞主要呈梭形，核大、核仁明显，平行排列生长或呈旋涡状生长。传代后细胞增殖迅速，7 d左右达到融合。此法获得的细胞形态上表现出良好的均一性（图1）。

　　2.2 流式细胞分析
    　　
　　以Sca1、CD44、CD45、CD11b单标对细胞表面标记进行流式检测，结果显示，Sca1和CD44的阳性率较高，分别为95.2%和99.7%；而CD45和CD11b阳性细胞分别占0.4%和1.5%。符合脂肪间充质干细胞的分子表面标记特性（图2）。

　　2.3 ADSCs与海藻酸钠微球联合培养

  　  ADSCs在微球内保持了球状形态，在接种密度(1×106/ml)下未见明显增殖（图3）。

　　2.4  Alcian Blue染色结果
    　　
　　Alcian Blue染色可以用来检测细胞外基质成分硫酸化氨基葡聚糖（GAG）。结果表明，在低氧诱导组（C组），细胞外基质成分的染色强度明显高于在正常氧浓度下诱导的B组，说明低氧可以促进细胞外基质的形成（图4）。

　　结果显示，诱导组（b组和c组）细胞外基质的形成明显高于非诱导组（a组）。而且在低氧诱导组（c组），细胞外基质的形成明显高于在正常氧浓度下诱导的b组，说明低氧可以促进细胞外基质的形成。

　　2.5.RT-PCR结果

   　 实验结果显示，在诱导培养基条件下1周后，Sox-9，Collagen II和Aggrecan基因的相对表达量在B、C组相对于A组有显著增加（P<0.05），而且C组高于B组（P<0.05）。同时，低氧条件下，转录因子HIF1a的相对表达量在C组较A、B组有明显增加（P<0.05），而A、B组无显著差异（P>0.05）。结果说明，转化生长因子促进了Sox9，Collagen Ⅱ、Aggrecan基因的表达，低氧进一步加强了这一促进效应（图5）。图5  PCR结果及各基因相对表达量分析表。分析结果表明，Sox-9，Collagen II、Aggrecan基因的相对表达量在B、C组较A组有显著增加（P<0.05），而且C组高于B组（P<0.05）。同时，转录因子HIF1a的相对表达量在C组较A组、B组有明显增加（P<0.05），而A组和B组无显著差异（P>0.05）。结果说明，转化生长因子促进了Sox9，Collagen Ⅱ、Aggrecan基因的表达，低氧进一步加强了这一促进效应。

　　3 讨 论
   
　　椎间盘退变性疾病的干细胞移植治疗一直是研究的热点［2～4］。Risbud MV等首先在低氧（2%O2）和含有转化生长因子（TGFbeta1）的成软骨诱导培养基条件下，把大鼠骨髓间充质干细胞与海藻酸钠微球联合培养，成功诱导其分化为髓核样细胞［6］。这为椎间盘退变性疾病的细胞移植治疗提供了新的思路。然而骨髓间充质干细胞获取困难、组织创伤大，且获得的干细胞数量有限，均一性较差，限制了该方法的临床应用；而脂肪间充质干细胞，因其来源丰富，获取方便而组织损伤小，体外增殖迅速，免疫原性低，且同样具有向脂肪、骨、软骨、神经等组织多向分化的潜能，备受关注［7～9］。因此，作者采用大鼠脂肪间充质干细胞作为向髓核样细胞诱导分化的细胞来源。
    　　
　　为了证明在特定条件下，大鼠脂肪间充质干细胞同样可以被诱导分化为髓核样细胞。在2%O2和含有TGFbeta1的成软骨诱导培养基条件下，把脂肪间充质干细胞与海藻酸钠微球联合培养，进行诱导分化。实验结果显示，分化后的脂肪间充质干细胞Sox9, Collagen Ⅱ和Aggrecan基因以及HIF1a基因的表达水平都有不同程度的增加。由于Sox9, Collagen Ⅱ和Aggrecan这3个基因是软骨细胞的特征性基因，表明诱导分化后的细胞是软骨样细胞。同时髓核细胞由于表达软骨细胞标记基因Sox9, Collagen Ⅱ、Aggrecan又被称作软骨样细胞［10］，且HIF1a基因在髓核细胞有较特征性的表达［11,12］，显示诱导分化后的脂肪间充质干细胞具备髓核细胞的表型。所以，在特定条件下，大鼠脂肪间充质干细胞可以被诱导分化为髓核样细胞。Alcian Blue染色结果进一步证实，诱导分化后的脂肪间充质干细胞是有功能的，可以分泌细胞外基质。这就为诱导后的脂肪间充质干细胞移植修复退变椎间盘提供了可能。
    　　
　　本实验在上述条件下进行诱导分化，是基于：（1）海藻酸钠微球可以用来模拟髓核细胞生存的细胞外环境，同时便于对诱导分化后脂肪间充质干细胞所分泌的细胞外基质进行检测；（2）因为椎间盘基本上是无血管的组织，局部血供少，氧张力低［13］，所以在较低的氧分压（2%O2）下进行诱导分化；（3） 而TGFbeta1可以使脂肪间充质干细胞沿着软骨方向分化［14］，促进Sox9, Collagen II and Aggrecan等软骨特征性基因的表达。
    　　
　　PCR结果还显示，低氧可以促进脂肪间充质干细胞向软骨方向分化，因为软骨特异性基因的表达在低氧条件下较正常氧浓度下有所增加。这也与之前的研究结果一致［15］。此外，实验还发现，取材时仔细剔除大鼠腹股沟脂肪垫处脂肪组织表面的筋膜组织及所含淋巴结，只选取不带微血管的小脂肪块，并通过极限稀释法挑选成纤维细胞样、核大、核仁明显的单细胞克隆进行传代培养，可以获得纯度比较理想的脂肪间充质干细胞。这从脂肪间充质干细胞表面抗原［16,17］Sca1、CD44、CD45、CD11b的流式分析结果不难看出。
    　　
　　本实验将ADSCs先在体外诱导分化后进行移植治疗，在ADSCs修复椎间盘退变性疾病史上尚属首次。
    　　
　　当然，本实验仅是在基因水平进行观察，至于在蛋白水平是否有相应的变化以及产生此结果的分子机制还不清楚。这将是下一步研究的重点。如果蛋白水平和基因水平的变化是一致的，那么便有可能利用脂肪间充质干细胞通过干细胞移植治疗椎间盘退变性疾病；同时，鉴于脂肪间充质干细胞相对于骨髓间充质干细胞的优势，从而使得椎间盘退变性疾病的干细胞移植治疗更具临床实用价值。

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作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科, 武汉 430030