cMET和COX2在肝细胞癌中表达的意义及其相关性

【摘要】  目的探讨cMET和COX2在肝细胞癌组织中表达的意义及其相关性。方法将2006年1月至2006年12月手术后经病理证实为肝细胞癌患者28例分为肝硬化组和非肝硬化组，再根据癌肿的大小分为大于5 cm组和小于5 cm组。采用免疫组织化学法对28例肝细胞癌患者肝组织进行染色，利用美国SimplePCI6专业图像分析系统截取显微镜下的10～15个视野，测算cMET和COX2的平均光密度值。结果肝硬化组的cMET和COX2平均光密度值均比非肝硬化组高；大于5 cm组的cMET和COX2平均光密度值均比小于5 cm组高； cMET和COX2呈正相关。结论HGFcMETCOX2VEGF通路可能是促进肝细胞癌血管生成的一个潜在通路，为肝细胞癌抗血管生成治疗策略提供新的靶点。

【关键词】  环氧水合酶类 cMET 肝肿瘤

    Relationship between cMET and COX2 expressed in hepatocellular carcinoma and its significance

    LU Changwei, DONG Jiahong (Institute of Hepatobiliary Surgery, Southwest Hospital, Third Medical Military University, Chongqing 400038, China)

    Abstract: Objective To study the relationship between cMET and COX2 expressed in hepatocelluar carcinoma as well as its significance. Methods Twenty eight cases hepatocelluar carcinoma were identified by pathology from January to December in 2006, Mean optical density of hepatocelluar carcinoma tissue slides stained by immunohistochmemical method was detected with professional photo analysis system (named SimplePCI6, made in USA). Results Mean optical density of cMET and COX2 in hepatocellular carcinaoma with hepatic cirrhosis is higher than without liver cirrhosis, and in hepatocellular carcinoma more than 5 cm higher than the ones of less than 5 cm.; cMET and COX2 was positively correlated. Conclusion cMET and COX2 may highly correlated in hepatocellular carcinoma, especially in angiogenesis of hepatocellular carcinoma. It is concluded that COX2 may be downstream factor of cMET. HGFcMETCOX2VEGF may be a potential pathway, which plays a great role in angiogenesis in hepatocellular carcinaoma.

    Keywords: cyclooxygenase; cMET; hepatocellular carcinoma

    cMET是由原癌基因cMET编码的一个蛋白，是肝细胞生长因子唯一受体蛋白。环氧合酶－2（cyclooxygenase2，COX2）是前列腺素合成限速酶，是炎症过程中的一个重要的诱导酶，已经有许多研究表明，COX2在肿瘤的血管生成中起重要作用，与肿瘤的复发和转移有关，在正常的肝组织中不表达COX2。研究表明，cMET和COX2分别与VEGF有密切关系［12］，cMET和COX2可能通过促进肿瘤的血管生成，影响肿瘤的复发和转移。近年来，以抑制肿瘤血管生成的策略来治疗肿瘤的研究成为一个崭新的热点，但是目前国内外文献均无肝细胞癌中cMET和COX2相互作用关系的研究，因此本研究拟探讨肝细胞癌中cMET和COX2表达的意义及其相关性。

      1材料与方法

    1.1材料 

    2006年1月至2006年12月经肝胆外科研究所手术切除病理证实为肝细胞癌患者的肿瘤组织标本28例，所选取的标本均为乙肝病毒携带、肿瘤大于2 cm且无肝外转移者，年龄28～75岁，平均47.8岁，男性26例，女性2例。其中肝硬化13例，无肝硬化15例。肿瘤大于5 cm 11例，小于5 cm 17例。所用COX2和cMET兔抗人多克隆抗体，PV9000二步法免疫组化检测试剂和浓缩型DAB试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。SimplePCI 6专业图像分析系统来自Cimpix公司。

    1.2方法

    1.2.1取材手术切除肝细胞癌病灶，于切除的肿瘤组织内取标本一小块，经40 g/L的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，分别做常规HE染色和免疫组化染色。

    1.2.2CMET和COX2检测采用PV9000二步法免疫组化检测系统进行检测。简述如下：脱蜡、水化组织切片，3％H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化酶，以微波枸橼酸盐进行抗原修复，滴加一抗，4 ℃过夜后PBS冲洗，滴加试剂1（Plymer helper）37 ℃孵育20 min，PBS冲洗后滴加试剂2（Polyperoxidaseantimouse/rabbit IgG），以DAB溶液显色，自来水冲洗、复染、脱水、透明、密封。用PBS 代替一抗作为染色的阴性对照，用已知的COX2和CMET染色阳性的乳腺癌组织切片标本作为二者的阳性对照。

    1.2.3结果判断于400倍显微镜下全面观察每张切片，染色阳性细胞为单纯细胞浆着色而核无着色，胞浆内有棕黄色至深棕黄色(或棕红色)颗粒者。每张切片采集10～15个视野（即10～15张测试图像），用SimplePCI 6专业图像分析系统（Cimpix INC.USA）测算其平均光密度值。

    1.2.4统计学处理应用SPSS11.5 软件进行t 检验和线性回归分析对所得结果进行分析，平均光密度值以±s表示。

    2结果

    2.1肝硬化组与非肝硬化组的表达

    COX2与 cMET在肝细胞癌中，肝硬化组与非肝硬化组的表达之平均光密度值差异非常显著（P＜0.01)，详见表1。表1COX2和cMET在两组中的表达

    2.2不同大小肿瘤中的表达

    COX2和CMET在肝细胞癌中，大于5 cm组与小于5 cm组的表达差异详见表2。表2肝细胞癌COX2和cMET的表达

    2.3COX2和cMET的相关性将COX2和cMET的平均光密度值进行线性回归分析，系数为0.7929，回归方程显著，方程有意义(方差F分析F值为44.02，P＜0.01)，提示cMET和COX2呈高度正相关。

    3讨论

    研究标明，COX2和cMET在结直肠癌、胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肾癌等恶性肿瘤中过表达，在恶性肿瘤的发生发展过程中起一定作用，尤其与恶性肿瘤的血管生成密切相关。COX2特异抑制剂能降低VEGF的表达，产生抗血管生成作用，这与VEGF启动子结合Sp蛋白的位点有关，可能与蛋白质降解体依赖的Sp1 、Sp4蛋白质的降解有关［3］。在正常的肝脏组织中不表达COX2，虽然很早就在肝细胞癌中检测到COX2的表达，但是其在肝细胞癌的发生发展过程中究竟起何作用，仍然未有定论。在肝细胞癌中，COX2上调VEGF的表达，其机制可能是通过前列腺素合成，而COX2上调VEGF的表达的效应可以被COX2抑制剂NS398阻断，提示COX2的上调表达与VEGF表达和肝细胞癌血管生成密切相关，COX2酶在原发性肝细胞癌的发生发展过程中有重要作用［45］。 Horiguchi等报道在HGF转基因小鼠中通过HGF自分泌途径，HGF/cMET信号转导通路cMET激酶活性增强，促进由突变剂二乙基亚硝基诱导的肝细胞癌的产生，微血管密度明显升高且可以观察到VEGF表达水平的升高，提示cMET可以通过上调VEGF的表达促进肿瘤血管生成［6］ 。因此认为，COX2和CMET参与了肿瘤血管生成，在肿瘤的发生发展过程中有重要作用，探索二者在肝细胞癌当中的相互关系有积极的意义。

    目前尚未见肝细胞癌中COX2和cMET相互关系的报道。本研究主要通过免疫组织化学法对28例肝细胞癌患者组织染色，利用美国Simple PCI6 专业图像分析系统截取显微镜下的10～15个视野，测算cMET和COX2的平均光密度值，分析和探索在肝细胞癌中COX2和cMET表达的意义。首先，目前一般认为肿瘤大于2 cm时，主要靠新生血管来提供营养支持，若无新生血管血供支持，肿瘤中心将坏死。肿瘤越大，越需要新生血管来提供营养支持。已经有研究证明cMET和COX2均可上调VEGF的表达［3，6］。因此，COX2和cMET在较大的肝细胞癌中呈更高表达来促进肿瘤血管生成，与肿瘤越大越需要新生血管形成提供营养支持相适应。肝硬化是肝细胞变性、坏死，引起炎细胞浸润，继而出现纤维组织增生和肝细胞结节状再生的过程，所以易于解释伴有肝硬化的肝细胞癌炎症因子COX2表达会比非肝硬化组更高。肝细胞生长因子作用于唯一受体蛋白cMET而促进肝细胞的增生，肝硬化肝细胞增生需要肝细胞生长因子的刺激，因此受体蛋白cMET的表达水平相应的会更高。表达水平更高的cMET和COX2，进一步促进VEGF的上调表达，增强肿瘤血管生成，促进肿瘤的增长。最后，HGF以一种剂量依赖的方式刺激胃癌细胞SCM1的生长，在胃粘膜细胞中，HGF上调COX2基因的表达和前列腺素的合成，可以被NS398阻断。Jones 等通过对实验大鼠胃上皮细胞的研究认为HGF通过cMET磷酸化和ERK2细胞信号转导途径，来诱发激活COX2基因的表达［78］。另外的研究表明，在过表达COX2的食管癌细胞中，以抑制COX2导致cMET表达下降［9］。结合本实验结果，cMET和COX2正相关，本文认为在肝细胞癌中，HGF作用cMET，cMET再与COX2相互作用，COX2再作用于VEGF，后者促进血管生成，即HGFcMETCOX2VEGF这条途径可能是促进肝细胞癌肿瘤血管生成，从而促进肿瘤生长的重要途径之一，可以为肝细胞癌抗血管生成的血管抑制治疗策略提供新的靶点和思路。

【参考文献】
  ［1］ 彭利，左连富，王顺祥，等.肝癌组织中COX2、VEGF、MMP2、MMP9的表达及相互关系的免疫组化研究［J］.实用肿瘤杂志，2005， 20（2），134-136.

［2］ 王玉萍，楚天骄，党秋红，等. 乳腺癌中肝细胞生长因子及其受体CMet和血管内皮生长因子表达的意义［J］.实用诊断与治疗杂志，2006，20(5)，336-338.

［3］ Abdelrahim M，Safe S. Cyclooxygenase2 inhibitors decrease vascular endothelial growth factor expression in colon cancer cells by enhanced degradation of Sp1 and Sp4 proteins［J］. Mol Pharmacol， 2005，68(2):317-329.

［4］ Tang TC， Poon RT， Lau CP， et al. Tumor cyclooxygenase2 levels correlate with tumor invasiveness in human hepatocellular carcinoma ［J］. World J Gastroenterol，2005，11(13):1896-1902.

［5］ Cheng AS， Chan HL， To KF， et al. Cyclooxygenase2 pathway correlates with vascular endothelial growth factor expression and tumor angiogenesis in hepatitis B virusassociated hepatocellular carcinoma［J］. Int J Oncol，2004，24(4):853-860.

［6］ Horiguchi N，Takayama H， Toyoda M，et al. Hepatocyte growth factor promotes hepatocarcinogenesis through cMET autocrine activation and enhanced angiogenesis in transgenic mice treated with diethylnitrosamine［J］.Oncogene，2002，21(12):1791-1799.

［7］ Chen JH， Wu CW， Kao HL， et al. Effects of COX2 inhibitor on growth of human gastric cancer cells and its relation to hepatocyte growth factor ［J］. Cancer Lett，2006，239(2):263-270.

［8］ Jones MK， Sasaki E， Halter F， et al. HGF triggers activation of the COX2 gene in rat gastric epithelial c ells: action mediated through the ERK2 signaling pathway ［J］. FASEB，1999，13(15):2186-2194.

［9］ Herrera LJ， ElHefnawy T， Queiroz PE， et al. The HGF receptor cMET is overexpressed in esophageal adenocarcinoma［J］. Neoplasia，2005，7(1):75-84.

［10］ Csiki I， Morrow JD， Sandler A， et al. Targeting cyclooxygenase2 in recurrent nonsmall cell lung cancer: a phase II trial of celecoxib and docetaxel［J］. Clin Cancer Res ，2005，11(18):6634-6640.

作者单位：第三军医大学附属西南医院肝胆外科医院、全军肝胆外科研究所，重庆 400038