HPV18E2蛋白CTL表位多肽的构建与表达

【摘要】  目的 分析HPV18E2蛋白的CTL表位，合成并纯化这些表位多肽，构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞，检验特异性CTL对靶细胞的杀伤效果，为进一步研制人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒(pBR322HPV18)为模板，利用PCR方法扩增HPV18E2 DNA片段，将HPV18E2 DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2HPV18E2EGFP)。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性。重组质粒转染Hela细胞。51Cr释放实验评估CTL杀伤能力。结果 克隆重组质粒pIRES2HPV18E2EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同，而且测序验证插入片段全序列无改变。转染并用G418筛选后，在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达。三条候选多肽特异性杀伤能力分别为60.00%、71.29%和80.00%。结论 三条备选肽段都具有明显的杀伤效应，均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。

【关键词】  人乳头瘤病毒18型；E2基因；多肽

　　Construction and expression of recombinant plasmid pIRES2HPV18EGFP

    WANG Yun, XIAO Lan, L Fenglin (Department of Histology and Embryology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

    Abstract: Objective   To analyse the function of epitopespecifical HPV18E2 CTL. Methods  The E2 gene of HPV18 was amplified by PCR from pBR322HPV18 and cloned into pIRES2EGFP. The sequence of cloned HPV18E2 was confirmed by restriction analysis and DNA sequencing. Then transfected into HeLa cells. The functional analysis is valued by 51Crrelease assay. Results  HPV18 E2 gene fragment was amplified by PCR and ligated to pIRES2EGFP, then transfected into HeLa cells successfully. The expression of green fluorescence cells was observed by fluorescence microscopy. The specific lysis of the cells from the three peptides was 60.00%, 71.29% and 80.00%. Conclusion  The three peptides have the ability to active epitopespecifical CTL. Based on them, a new peptides vaccine maybe constructed.

    Keywords: human papillomavirus type18; E2 gene; polypeptide

    宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。宫颈癌的发生可能与性生活紊乱，过早性生活，早年分娩，多产，地理环境等因素有关。分子生物学研究结果显示90%以上的宫颈癌伴有人乳头瘤病毒(HPV)感染。宫颈癌以鳞状细胞癌最为多见，其次为腺癌和腺鳞癌等。高危型HPV的感染是诱发宫颈癌的必要条件，尤其是HPV16型和18型。E2是一种反式激活蛋白，涉及病毒DNA转录的反式激活，能延缓染色体有丝分裂的进程，具有抑制癌细胞生长的功能。本实验是以加强绿色荧光质粒pIRES2EGFP为载体，构建了HPV18E2蛋白的真核表达质粒pIRES2HPV18E2EGFP，为制作宫颈上皮内瘤变的治疗性多肽疫苗打下基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    菌株：E.coli DH5 (由本实验室保存)。质粒：①pBR322/HPV18，含目的基因的重组质粒，由德国癌症研究中心EM de Villiers教授惠赠；②pIRES2EGFP：含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体，Clontech公司，由Professor Roger Y. Tsien（University of California, San Diego, U.S.A）惠赠，含有Kan+抗性基因。HeLa细胞株，购自协和医科大学基础医学研究所。主要试剂：pfu高保真DNA聚合酶(上海生物工程公司)；质粒抽提试剂盒(Omega公司，美国)；DNA凝胶回收试剂盒(上海华舜生物有限公司)；BamH I、EcoR I内切酶(大连TaKaRa公司)；T4DNA连接酶试剂盒(大连TaKaRa公司)；DL2000 Marker(大连TaKaRa公司)；DL15000 Marker(大连TaKaRa公司)；PCR克隆引物(上海生物工程公司)，上游引物：5’CGGAATTCATGGA

    GACTCTTTGCC3’；(下划线部分为BamH I酶切位点，5’端为保护性碱基)，下游引物5’CGGAATTCATGCAGACACCGAAGC3’(下划线部分为EcoR I酶切位点，5’端为保护性碱基)；Gene Jammer Transfection Reage(Stratagene公司，美国)；质粒中量抽提试剂盒(Omega公司，美国)；DMEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(四季青公司，中国)；HEPES(GIBCO公司，美国)；胰蛋白酶(Sigma公司，美国)。

    1.2  实验方法

    pIRES2HPV18E2EGFP重组质粒的构建及质粒DNA转染HeLa细胞。外周血单个核细胞的分离及经典51Cr释放实验。

    2  结果

    2.1  重组质粒酶切鉴定结果

    质粒pIRES2HPV18E2EGFP经BamH I和EcoR I双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳。重组质粒双酶切在DL2000 Marker 1 000 bp条带稍靠后处出现两条特异性条带，应分别为载体片段和目的片段，初步证明构建正确(图1)。

    图1  重组质粒pIRES2HPV18E2EGFP酶切产物电泳

    2.2  重组质粒DNA序列测定

    质粒pIRES2HPV18E2EGFP由重庆医科大学分子生物学实验室测序。测序结果与NCBI公布的HPV18E2基因对比表明，插入的基因序列与HPV18E2基因序列正确吻合，表明重组质粒成功，命名为pIRES2HPV18E2 EGFP。

    2.3  HeLa细胞pIRES2HPV18E2EGFP绿色荧光蛋白的表达

    转染后第4天加入G418进行筛选，在G418终浓度为600 mg/L时，细胞大量死亡，仅余少量贴壁细胞成活。维持此筛选浓度，培养基血清浓度改为20%，再筛选7 d后，荧光显微镜下见成活的贴壁细胞中，带有荧光的明显增多，约占细胞总数的50%(图2)。由于表达报告基因的细胞必然同时表达目的基因，转染成功的同时已成功构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞模型。

    2.4  特异性CTL杀伤效能的检测

    经三条备选肽段刺激后得到的CTL具有明显的表位特异性杀伤能力。随着CTL与靶细胞比例(效靶比)的增加，靶细胞溶破率亦不断升高。而无关肽刺激得到的CTL在与靶细胞的反应中，未体现出明显的杀伤效果，当效靶比为12.5∶1、25∶1和50∶1时特异性杀伤率均小于5%，而在效靶比为100∶1时，也仅为2.7%，远远小于备选肽段的特异性杀伤率（图3）。

    在效靶比为12.5∶1、25∶1和50∶1时，三条肽段刺激得到的CTL杀伤效应没有明显的区别，而在效靶比为100∶1时，肽段3诱导得到的特异性CTL杀伤效应明显高于肽段2，而肽段2又明显高于肽段1，三者的特异性杀伤率从高到低依次为60.00%、71.29%和80.00%，都具有明显的杀伤效应，说明三条备选肽段均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。

    3  讨论

    HPV18E2蛋白编码基因序列位于HPV18基因组第2 817至3 914位，其蛋白由365个氨基酸构成［1］。E2是一种反式激活蛋白，涉及病毒DNA转录的反式激活。而且E2能延缓染色体有丝分裂的进程［2］。在HPV相关的恶性肿瘤中，病毒DNA常整合到宿主染色体中。相比之下，在癌前病变及宫颈上皮内瘤样变中却很少有整合。整合形式的HPV才具有恶性转化能力，因为HPVDNA控制了宿主基因物质而产生HPV编码的蛋白。因此，整合常被认为是癌前病变转变为癌的激活机制之一［3］。HPV中的16型和18型是引发宫颈癌的主要型别。有研究发现HPV18感染在腺癌及腺鳞癌中更常见［4］。而且更易发生骨盆淋巴结转移和间质浸润，复发率也相对较高［5］。整合HPV18基因到宿主细胞后对癌的发生发展起决定性作用。其基因编码两种蛋白E1及E2。E2能结合HPV的早期启动子，从而抑制E6、E7转录。高危型HPV感染宫颈上皮后，病毒组DNA整合到染色体中，其E6和E7基因产物的持续表达，是诱发宫颈癌的主要原因［6］。因此，E2失去表达后将导致病毒癌基因的激活。在HPV18感染的细胞株中E2处于灭活状态，E2的功能即是抑制癌的发展［7］。将E2导入HPV感染的癌细胞中将抑制细胞生长，使其细胞周期停在G1期，衰老及凋亡。E2蛋白作为病毒DNA复制和基因表达的主要调控蛋白，在感染早期的病毒复制阶段和宫颈上皮内瘤变Ⅰ期(CINⅠ)高表达。这是因为在宫颈上皮瘤后期病变和高恶性度的宫颈癌中，病毒基因组线性化整合入人基因组中时，E2基因已经发生了断裂［8］。最近也有研究发现，机体针对HPV16之E6、E7蛋白的细胞免疫在有些时候并不能彻底清除HPV感染的细胞，说明机体对高危型HPV病毒（HPV16、HPV18）E6、E7蛋白的反应与病变的自行消退没有必然联系。Brandsma发现在兔乳头瘤（cottontail rabbit papillomavirus，CRPV）模型中，表达HPV E2的腺病毒疫苗能清除HPV的感染［9］。由此本文认为，E2蛋白将是一个新的治疗性靶蛋白。现阶段有关E2基因的疫苗已在宫颈上皮内瘤变中取得了初步的研究进展［10］。HeLa细胞是宫颈癌细胞株系，因整合HPV18 E2基因而永生化。在本文的研究中，体外刺激外周血单个核细胞(PBMC)，诱导表位特异性CTL时，加入表位肽的同时也加入了rhIL2，培养2周后见到明显的淋巴细胞增殖。在实验的最后结果中，肽段1、2、3的溶破率分别为60.00%、71.29%和80.00%，都具有明显的杀伤效应，说明三条备选肽段均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。也为以后宫颈上皮内瘤变的治疗性多肽疫苗研制打下基础。

【参考文献】
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［8］ Albarran Y Carvajal A, de la Garza A, Cruz Quiroz BJ, et al. MVA E2 recombinant vaccine in the treatment of human papillomavirus infection in men presenting intraurethral flat condyloma: a phase I/II study［J］. Bio Drugs, 2007, 21(1): 47-59.

［9］ Brandsma JL, Shlyankevich M, Zhang L, et al. Vaccination of rabbits with an adenovirus vector expressing the papillomavirus E2 protein leads to clearance of papillomas and infection［J］. J Virol, 2004,78(1):116-123.

［10］ Garcia Hernandez E, Gonzalez Sanchez JL, Andrade Manzano A, et al. Regression of papilloma highgrade lesions (CIN 2 and CIN 3) is stimulated by therapeutic vaccination with MVA E2 recombinant vaccine［J］. Cancer Gene Ther, 2006,13(6): 592-597.

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