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【摘要】 目的 建立多种种属外周血间充质干细胞(MSCs)的分离培养方法,探讨其对粒细胞集落刺激因子(GCSF)的动员反应。方法 用percoll(1.131 g/mL)分离多种种属外周血单个核细胞,进行贴壁培养MSCs。以GCSF作为动员剂,培养骨髓和外周血来源的MSCs,计数动员前后的成纤维细胞集落形成单位(CFUF)。结果 对多种种属进行外周血MSCs分离培养,成功率不同。在本实验条件下,可以稳定的直接分离培养出大鼠外周血的MSCs。GCSF动员后,骨髓来源MSCs的CFUF数量显著高于对照组(P<0.01);外周血来源MSCs的CFUF数量也显著高于对照组(P<0.01),接近4倍。结论 不同种属外周血MSCs分离培养难易不同,其直接原因是生理条件下外周血中存在的MSCs量少导致的。GCSF可以有效地动员大鼠骨髓和外周血MSCs。
【关键词】 间充质干细胞;动员;粒细胞集落刺激因子;细胞培养
The feasibility analysis of MSCs mobilization by GCSF and its prosthetic effection in traumatic brain injury
DENG Jun, ZOU Zhongmin, ZHANG Chunlei, WANG Junping, AI Guoping, SU Yongping (State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Institute of Combined Injury, College of Preventive Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
Abstract: Objective To establish the isolating cultural method of MSCs from some genus peripheral blood (PB), and explore the mobilization response of MSCs by GCSF. Methods MSCs from some genus PB were isolated by percoll (1.131 g/mL) and carried out adherent culture. MSCsderived bone marrow and PB were cultured and its CFUF were counted after mobilization by GCSF. Results PB MSCs were isolated and cultureed successfully or unsuccessfully from different genus. Under our experiment condition, rat’s PB MSCs could been isolated and cultured steadily. A significantly higher number of CFUF of BMderived MSCs and PBderived MSCs than that of control group after mobilization by GCSF(P<0.01),almost 4fold increase. Conclusion PB MSCs were isolated and cultured successfully or unsuccessfully from different genus, it concerned with a small number of circulating MSCs in BP. We confirmed that GCSF mobilized BMderived MSCs, especially PBderived MSCs by CFUF assay.
Keywords: mesenchymal stem cell; mobilization; GCSF; cell culture
正常生理情况下,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)大量存在于骨髓,循环血液中仅有少量。已有研究证实可从胎儿和新生儿血液中分离培养出循环MSCs[1]。但从成熟个体外周血中分离MSCs,因受实验人员、环境、方法等影响,有成功[2]也有失败的[3]。对不同种属动物(或人)的外周血MSCs进行分离培养,其结果也不一样。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor,GCSF)作为体内重要的调节因子,自GCSF分子克隆和基因合成成功以来,在临床上已广泛应用。而GCSF大量应用于白血病的临床治疗,主要得益于其对造血干细胞的有效动员。那么除了动员造血干细胞外,GCSF能否动员骨髓细胞中的MSCs或其他干细胞,还存在着很大争议[4]。因此,本研究对不同种属的外周血MSCs进行分离培养,在本实验室条件下建立成熟的分离培养外周血MSCs的方法,并探讨GCSF能否有效动员外周血MSCs。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂
2月龄的健康清洁SD大鼠,体重100~150 g,雌雄不拘。健康C57BL/6小鼠,雌雄不拘,SPF级,6周龄,体重20~25 g。健康日本大耳白兔。动物均由本校实验动物中心提供。MEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司,美国),GCSF(齐鲁制药有限公司)。
1.2 外周血MSCs的直接分离和培养
1.2.1 实验标本 为了探讨在本实验条件下,能否直接从外周血中分离培养出MSCs,拟对小鼠、大鼠、兔、人的外周血进行MSCs分离培养。标本分别为:①C57BL/6小鼠4只;②SD大鼠4只;③日本大耳白兔外周血4份;④人(志愿者)外周血4份。小鼠和大鼠外周血标本通过剪开的股动脉采集,用肝素化管分别收集0.8 mL和5 mL外周血;兔外周血标本为股动脉处抽取5 mL血液;人外周血标本为肘部静脉抽取5 mL血液。
1.2.2 细胞分离和培养 分别将各外周血标本用percoll(1.131 g/mL)分离单个核细胞,制成细胞悬液,计数后以6×105 /cm2密度接种于培养瓶,置于5% CO2、37 ℃孵箱。48 h后全量换液,去除悬浮细胞,以后3~4 d半量换液。细胞达80%~90%融合后,用0.25%胰酶消化传代。
1.3 GCSF对大鼠MSCs的动员效应
1.3.1 实验分组 2月龄的8只SD大鼠分为2组。正常对照组(BMN表示骨髓源MSCs对照组,PBN表示外周血MSCs对照组):4只大鼠连续5 d尾静脉注射0.9% NaCl 0.5 mL。GCSF动员组(BMG表示骨髓源MSCs的GCSF动员组,PBG表示外周血MSCs的GCSF动员组):4只大鼠连续5 d尾静脉注射GCSF(20 μg·d-1·kg-1)0.5 mL。
1.3.2 外周血和骨髓样本的收集培养 对照组和GCSF动
a:大鼠外周血MSCs;b:人外周血MSCs
图1 直接分离、培养外周血MSCs(×100)员组5 d后收集骨髓样本,获取MSCs。具体操作为,游离股骨,清除股骨周围软组织,离断股骨头。用DMEM/F12(含20%胎牛血清)培养基冲洗股骨头断端,制成细胞悬液,计数后以5×105 /cm2密度接种于培养瓶,置于5% CO2、37 ℃孵箱。48 h后全量换液,去除悬浮细胞,以后3~4 d半量换液。细胞达80%~90%融合后,用0.25%胰酶消化传代。外周血样本的收集:剪开大鼠股动脉,用肝素化管收集5 mL外周血。用percoll(1.131 g/mL)分离单个核细胞,制成细胞悬液,计数后以6×105 /cm2密度接种于培养瓶,以后方法同骨髓MSCs的培养。
1.4 成纤维细胞集落形成单位(CFUF)分析
细胞消化后(第一代)以105总量接种于25 cm2的培养瓶,培养液为含15%胎牛血清的DMEM/F12,置入5% CO2、37 ℃孵箱。48 h后全量换液,7 d后,计数成纤维细胞集落形
a:骨髓MSCs对照组;b:骨髓MSCs的GCSF动员组;c:外周血MSCs的GCSF动员组
图2 大鼠骨髓和外周血第一代MSCs的集落形成(×100)
a:总数为105骨髓来源细胞中的CFUF数量;b:总数为105外周血来源细胞中的CFUF数量;*:与BMN比较,P<0.01;#:与PBN比较,P<0.01
图3 骨髓和外周血MSCs的CFUF分析
成单位(CFUF),每细胞集落形成单位含50个以上细胞。
2 结果
2.1 外周血MSCs的直接分离和培养结果
小鼠外周血标本血量太少,培养48 h换液后,只有少数几个散在细胞贴壁,且不能呈梭形生长,培养一段时间后逐渐死亡。大鼠外周血标本均能培养出MSCs(图1a)。兔外周血标本全部不能培养出MSCs。人外周血标本有两份标本能培养出MSCs(图1b)。
2.2 GCSF对大鼠MSCs的动员效应
成功培养出大鼠外周血来源和骨髓来源的MSCs。观察细胞集落的形成(图2),进行CFUF分析。结果显示GCSF动员后,骨髓来源MSCs的CFUF数量显著高于对照组(P<0.01)。BMN、BMG的CFUF值(±s,n=4)分别为29.50±3.87、49.75±4.57。同样,经GCSF动员后外周血来源MSCs的CFUF数量也显著高于对照组(P<0.01)。PBN、PBG的CFUF值(±s,n=4)分别为7.25±1.26、24.75±2.63,PBG较PBN增高接近4倍(图3)。
3 讨论
近年来,干细胞由于多向分化的潜能而越来越受到重视,也成为细胞工程、再生医学中的主要选择细胞[5]。现今MSCs主要是从骨髓中获取,能否从成体外周血中分离和培养出MSCs还没有定论[23]。在不同的实验条件下,从外周血中分离和培养MSCs的结果也不一样。为了探讨在本实验条件下,能否直接从外周血中分离培养出MSCs,本研究对小鼠、大鼠、兔、人的外周血进行MSCs分离培养。结果表明即使在同样实验条件下,分离培养不同种属MSCs的成功率也不一样。研究显示,在培养骨髓原代MSCs时,需要接种合适的细胞量,细胞太少会减少细胞间的联系和支持,从而导致MSCs的滞长。在外周血MSCs培养过程中,本研究发现细胞培养后24~48 h内,贴壁细胞多的可以培养成功,而贴壁细胞少的则很难培养成功。本文认为动物和人的外周血中都存在MSCs,但外周血中的MSCs量少直接导致了对其分离培养的困难,如小鼠的血液能取出的量不过1 mL,所以很难培养出外周血MSCs。本实验显示在本实验条件下,能稳定地分离培养出大鼠外周血MSCs,故以大鼠为实验模型,研究动员后外周血MSCs的细胞特性较可靠。
循环血中虽然存在MSCs,但要达到细胞治疗的目的,还必须利用外来因素刺激动员骨髓内的MSCs,使其大量释放进入循环血。研究显示,GCSF是造血干细胞的有效动员剂,但对于其他干细胞如MSCs的动员、循环,却存在着争议。CFUF被认为是比较成熟的MSCs后代和间质的前体细胞,CFUF分析可用来评估培养体系中MSCs的数量。在本实验中通过CFUF分析,证实GCSF能有效动员骨髓和外周血中的MSCs,尤其是对外周血中的MSCs动员更明显。可见经GCSF动员5 d后,骨髓内MSCs的大量增加,可能与在壁龛(niche)内处于静止的MSCs被激活增生有关。由于正常条件下骨髓内MSCs的量远远大于外周血中的MSCs,经GCSF动员使骨髓MSCs释放到外周血,就会导致外周血中MSCs增加量相对很高。
【参考文献】
[1] Lee MW, Choi J, Yang MS, et al. Mesenchymal stem cells from cryopreserved human umbilical cord blood[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004,320(1):273-278.
[2] Porada CD, Zanjani ED, Almeida Porad G. Adult mesenchymal stem cells: a pluripotent population with multiple applications[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2006,1(3):365-369.
[3] Pountos I, Corscadden D, Emery P, et al. Mesenchymal stem cell tissue engineering: techniques for isolation, expansion and application[J]. Injury, 2007,38(Suppl 4):S23-S33.
[4] Zvaifler NJ, Marinova Mutafchieva L, Adams G, et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals[J]. Arthritis Res, 2000,2(6):477-488.
[5] Chan BP, Hui TY, Yeung CW, et al. Selfassembled collagenhuman mesenchymal stem cell microspheres for regenerative medicine[J]. Biomaterials, 2007,28(31):4652-4666.
作者单位:(1.第三军医大学军事预防医学院防原医学教研室,全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400038;2.深圳市中医院检验科,广东 深圳 518033)