SHP基因多态性与出生体重和胰岛素敏感性关系的双生子研究

【摘要】  目的 探讨微小异源二聚体伙伴基因(small heterodimer partner gene,SHP)多态性与出生体重和胰岛素敏感性的关系，检测SHP基因的SNP位点rs7504多态性。方法 采用DNA鉴定393对双生子（其中单卵双生子256对，二卵双生子137对）卵型，问卷询问出生体重，稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)衡量胰岛素敏感性，PCR-RFLP检测SHP基因SNP位点rs7504多态性，非参数连锁分析基因多态性与出生体重和胰岛素敏感性的关系。结果 双生子人群TT，TC和CC基因型频率分别为84.9%，14.1%和1.0%。状态一致(identity by state，IBS)为2时双生子同胞间血糖和HOMA-IR组内相关系数大于IBS为1时；携带C突变等位基因者BMI、血糖和出生体重较高，但差异无统计学意义。结论 SHP基因多态性可能与胰岛素敏感性及出生体重有关，作用仍有待于进一步研究。

【关键词】  多态性，单核苷酸；出生体重；胰岛素；敏感性与特异性；双生研究

　　A Twin Study on Association of SHP Polymorphisms with Birth Weight and Insulin Sensitivity/

　　CHEN Tianjiao, JI Chengye, WANG Ying, et al.

　　Institute of Child and Adolescent Health, Peking University, Beijing (100083), China
   
　　【Abstract】  Objective  To study the effect of SHP (small heterodimer partner gene) polymorphisms on birth weight and insulin resistance, and to detect the SHP rs7504 polymorphisms. Methods  DNA microstatellite polymorphism was used to diagnose zygosity of 393 twin pairs (MZ 256, DZ 137). Birth weight was gained by questionnaire and insulin sensitivity was estimated with logarithm transformed homeostasis model assessment (HOMA). PCRRFLP analysis was performed to detect the SHP rs7504 polymorphisms. Identity by state (IBS) of nonParametric Linkage Analysis Methods was used to analyze the association of polymorphisms with birth weight and insulin sensitivity. Results  The genotype frequencies of TT, TC and CC were 84.9%, 14.1% and 1.0%. The interclass cotwin correlations of blood glucose, and HOMAIR of those twin pairs sharing 2 alleles of IBS were greater than those sharing 0-1 alleles of IBS. BMI, blood glucose and birth weight of those carrying the mutant C allele were higher, but the differences had no statistical significance. Conclusion  SHP polymorphisms might be associated with insulin resistance and birth weight, further studies are necessary to confirm the results.
   
　　【Key words】  Polymorphism, single nucleotide; Birth weight; Insulin; Sensitivity and specificity; Twin studies

　　胰岛素抵抗和高胰岛素血症是代谢综合征的基础［1］，并被认为是联系肥胖与冠心病、高血压、糖尿病的中心环节。儿童和青少年虽很少发生上述明显的疾病，但是其潜在危险(糖、脂代谢异常和高血压倾向)却普遍存在［2］。近年来越来越多的流行病学研究显示，低出生体重与青少年及成年期的胰岛素抵抗综合征的发生密切相关，发生机制尚不明确，可能是由于早期营养不良导致的程序化，也可能是由于共同的遗传基因作用。
   
　　双生子研究是研究遗传和环境影响的重要手段。双生子又是研究基因多态性与功能关系的特殊人群，双生子同胞年龄相同，宫内环境及早期生活环境相似，在研究基因和表型之间的相关性时可以更好地控制混杂因素，在验证胎源性假说时有特殊意义［3-4］。
   
　　微小异源二聚体伙伴基因(small heterodimer partner gene，SHP) 编码的蛋白产物是核受体超家族的成员之一，与其他多种激素受体相互作用，同时能增强过氧化物酶体增强激活受体（PPAR) 的转录活性，参与胆固醇代谢。有研究发现，SHP基因与日本人轻、中度肥胖及出生体重增加有关，提示SHP基因可能参与胎儿宫内发育的调节［5］。笔者的研究目的是检测SHP基因的SNP 位点rs7504多态性。

　　1  对象与方法

　　1.1  对象  依据山东省青岛市双生子登记系统，收集5～18岁双生子393对,其中单卵双生子（MZ）256对，二卵双生子（DZ）137对；平均年龄(12.0±3.5)岁。同一对双生子在同一天受检，并取得家长及本人的知情同意。经严格体检和问卷询问，排除影响血糖或胰岛素疾病者、各类继发性肥胖及1个月内服用减肥、降糖降脂等药物者。

　　1.2  方法

　　1.2.1  卵型鉴定  卵型鉴定应用DNA短串联重复序列（STR）进行。酚氯仿法提取血凝块中DNA，PCR复合扩增4个多态性位点D16S539, D7S820, D13S317, D5S818（美国Promega公司试剂盒），荧光标记引物，产物经垂直凝胶电泳和激光扫描后，比较4个位点的一致性以鉴别卵型，可靠性达99.6%以上。该项工作在北京法医鉴定中心生物物证室完成。

　　1.2.2  测量指标  包括身高（cm）、体重（kg）、体质指数（BMI，kg/m2）、腰臀围比（WHR）、血糖（GLU，mmol/L）、胰岛素（INS，mU/L）、出生体重（g）。出生体重由问卷询问得到；身高及体重测量按《中国学生体质健康状况调研细则》进行；体质量指数计算为体重（kg）/身高2（m2）。受检双生子于清晨空腹采血（禁食至少8 h），同一对双生子间隔采血时间小于5 min；葡萄糖氧化酶法测定血糖，放射免疫法测定血胰岛素（中国原子能科学研究所）。现场和实验室质控均符合要求。胰岛素敏感性评估采用稳态模型胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment insulin resistance index,HOMA-IR）：HOMA-IR =FPG×FINS/22.5（FPG为空腹血糖，FINS为空腹胰岛素），模型建立基于血糖和胰岛素在不同器官的相互影响，反映机体的胰岛素抵抗。

　　1.2.3  基因多态性检测  应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测SHP rs7504多态性。PCR上游引物为：5'-GGACCTCTTCTTTCGCCCTATC-3'；下游引物为：5'-TGGTCCAATAAGCAGCCTAAGC-3'（北京奥科公司合成）。25 μL的PCR反应体系中，模板DNA 100 ng，Tag酶0.5 IU。反应条件为：(1)预变性94℃，5 min；(2)35个循环，每个循环94℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1 min；(3)终末延伸72℃，5 min。PCR反应产物以BsiHKA-Ⅰ(NEB)酶切，65℃水浴16 h。2.5%琼脂糖凝胶电泳，150 V，25 min，紫外灯下读取基因型。共3种SHP基因型：TT(363 bp) ，TC(101 bp，262 bp，363 bp)，CC(101 bp，262 bp)。

　　1.2.4  统计分析  在基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡的双生子人群中进行如下分析。
   
　　比较具有相同等位基因的二卵双生子同胞对内变量的相关，采用非参数连锁分析方法，以基因多态性为标记，分别比较当状态一致(identity by state，IBS)为0，1和2时双生子同胞间各性状指标差值平方的大小及双生子组内相关系数。W检验分布正态性，HOMA-IR为偏态分布，统计分析时经自然对数转换。正态资料比较采用配对t检验，非正态资料采用配对的非参数检验（Wilcoxon MatchedPairs，SignedRanks Test）。调整性别和年龄。分析采用SPSS 13.0软件完成。

　　2  结果

　　2.1  基因多态性结果  SHP基因多态性鉴定结果如图1。TT,TC和CC基因型频率分别为84.9%，14.1%和1.0%。T，C等位基因频率分别为92.0%和8.0%。χ2检验显示，该双生子人群基因型分布符合HardyWeinberg平衡，说明该群体基因已达到遗传平衡，具有代表性。

　　注：M为DNA Marker；1，2道CC基因型(101 bp，262 bp)；3，4道TC基因型(101 bp，262 bp，363 bp)；5，6道TT基因型(363 bp)

　　图1  SHP基因多态性鉴定垂直凝胶电泳激光扫描图（略）

　　2.2  基因多态性与各性状水平的关系  随机抽取双生子对中的一个，分析基因型和各性状水平的关系。将CC与TC合并在一起，双生子分为未携带突变等位基因的野生型（TT）和携带突变等位基因的突变型（TC，CC）进行分析，发现突变者BMI、血糖和出生体重与未突变者差异无统计学意义(表1)。SHP基因野生型和突变型对象出生体重与各性状指标关系的比较显示，野生型和突变型中BMI均与出生体重正相关，血糖均与出生体重负相关；而对于胰岛素抵抗指数，野生型与出生体重负相关，突变型为弱正相关。见表2。提示野生型出生体重越低，胰岛素抵抗指数越高；而突变型似乎对此有保护作用。

　　表1  SHP基因野生型和突变型各检测指标比较（略）

　　表2  双生子各检测指标SHP基因野生型和突变型出生体重的相关分析（略）

　　2.3  双生子同胞间IBS不同时各指标的组内相关系数  单卵双生子中，以SHP基因多态性为Marker，比较当IBS为0，1和2时双生子同胞间各性状指标的差异及组内相关系数，见表3。

　　表3  SHP基因位点共享不同等位基因数目的双生子同胞间各指标相关分析（略）

　　SHP位点双生子同胞间IBS为0，1，2的双生子分别有1，18，118对。因IBS为0的双生子对数太少，将其放入IBS为1组参加分析。见图2，3。

　　图2  SHP位点IBS为1时双生子血糖的组内相关（略）

　　图3  SHP位点IBS为2时双生子血糖的组内相关（略）

　　IBS为1时，有WHR和GLU双生子对内差异大于IBS为2时，但差异无统计学意义。IBS为2时，血糖和反映胰岛素敏感性的HOMA-IR在双生子两者间的相关系数较大，而血糖在IBS为1时相关系数很低，且差异无统计学意义；IBS为2时组内相关系数有显著性。提示这些指标与SHP的多态性有关。其余各指标相关系数在IBS为1时稍大于IBS为2时，可能与IBS为2时双生子对数较多有关，提示其与SHP的多态性关系不大。

　　3  讨论
   
　　本研究双生子人群TT，TC和CC基因型频率分别为84.9%，14.1%和1.0%；T，C等位基因频率分别为92.0%和8.0%。与国内某研究结果相似，但与白种人明显不同，与美国印第安人相近［6］。
   
　　本研究采用源于患病同胞对分析的IBS概念，分析基因多态性与各性状指标的关系。IBS为2时双生子同胞间血糖和HOMA-IR组内相关系数大于IBS为1时，说明SHP基因多态性与血糖和胰岛素敏感性有某种程度的关联。而比较当未携带C（TT）和携带C（TC，CC）基因时各指标的均值发现，突变者BMI，血糖和出生体重高于未突变者，但差异无统计学意义。与突变者出生体重更高且有统计学意义的结果不一致，这可能是由于双生子人群较为特殊，平均出生体重较低，难于发现区别；或SHP基因多态性并非是胰岛素抵抗或者出生体重的主要遗传因素，也可能是衡量胰岛素敏感性的指标不够精确引起［6］。比较野生型和突变型对象出生体重与各性状指标关系发现，野生型和突变型中出生体重越低，BMI越低，血糖越高。对于胰岛素抵抗指数，野生型出生体重越低，胰岛素抵抗指数越高；而突变型却相反，似乎对此有保护作用。某大型双生子研究结果显示，低出生体重和糖尿病可能存在由宫内环境引起的程序化影响，不排除有共同遗传因素作用［7］。笔者认为二者之间也存在相互作用。
   
　　有研究认为，SHP基因突变导致其抑制HNF-4а转录活性的功能下降,从而HNF2-а的活性增强，导致胰岛素分泌增加［5］。胎儿胰岛素增加致使胎儿生长加速，出生体重增加，为日后肥胖奠定基础。另外，SHP基因突变可能增强脂肪合成中起重要作用的PPARs的转录活性［8］，可能与脂肪细胞分化和肥胖有关。本研究中突变与BMI、血糖和出生体重的关系似乎也从一方面支持以上结果，但仍需进一步扩大样本研究。笔者本次也检测了双生子中PPARγ2的Pro12Ala基因多态性，结果发现，这2个基因可能对BMI、腰臀围比、血糖、胰岛素、HOMA-IR等指标有联合作用［9］。
   
　　SHP基因多态性可能与血糖、胰岛素敏感性及出生体重有关，但仍有待于进一步研究。

【参考文献】
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作者单位：北京大学儿童青少年卫生研究所，北京 100083；北京大学医学部基础医学院。