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【摘要】 目的 探讨VEGF基因蛋白表达与鼻咽癌颅内转移发生的关系。方法 用VEGF多克隆抗体对50例鼻咽标本进行免疫组织化学染色（SP法）。结果 在鼻咽癌中，VEGF蛋白表达与颅内转移的发生有关（P<0.01）。结论 鼻咽组织中VEGF表达上调对脑转移癌的发生具有重要作用，检测鼻咽癌组织中VEGF蛋白表达水平可能是预测鼻咽癌颅内转移的重要指标。
Key words immunohistochemistry VEGF encephalic metastasis of nasopharynx carcinoma
鼻咽癌（nasopharynx，NPC）是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤，华南高发区发病率高达14.68～18.53/10万人口 ［1］ 。广东四会县更是高达25.12/10万人口。鼻咽癌病死率在全身恶性肿瘤中的比例，全国居第八位，两广居第三位，湖南居第四位。肿瘤转移对癌细胞来说也是个复杂而艰辛的工程。要完成这个工程，癌细胞必须具备多方面出众性质和获得适当的机会，肿瘤发生至转移形成并非轻而易举。有实验表明，每克瘤组织24h可向血中释放（3.2×l.4）×10 6 的瘤细胞，但最终能存活并形成转移瘤的不足1/5000～1/1000。瘤细胞一旦进入脉管，必须逃逸宿主免疫细胞的攻击和血压、血液旋流的物理性冲击等，绝大部分癌细胞会死亡。肿瘤转移往往是肿瘤患者死亡的直接原因，鼻咽癌是以高转移性为突出特点的恶性肿瘤，大部分患者由于早期发生转移而预后不良 ［2～4］ 。
因鼻咽部毗邻颅底，病变容易破坏颅底并向颅内侵犯，颅内转移是鼻咽癌首发或治疗后远处转移的主要部位之一，为威胁鼻咽癌患者生命的主要原因 ［5～8］ 。CT、MRI以其断面成像和良好的组织分辨率，很好地显示了鼻咽部、颅底和绵窦等结构，因而对NPC颅底及颅内侵犯的评价具有重要价值。但我们肉眼可见的直径约1cm大小的瘤体已含的10 9 个癌细胞;故迫切需要阐明鼻咽癌颅内侵袭和转移有关机制对其转移进行有效防治。
笔者采用免疫组织化学方法（SP法）对50例鼻咽疾患患者鼻咽组织中的VEGF蛋白表达进行研究，探讨鼻咽癌 脑转移的发生机制。
1 临床资料
1.1 一般资料 湖南省肿瘤医院2003年5月～2004年5月首次确诊为鼻咽癌的病人及同期确诊为慢性鼻咽炎的湖南境内患者50例，确诊前3个月未接受特殊治疗的患者。采用随机数字平行阳性对照、自身前后对照观察设计方案。采用临床试验单位的住院病例和门诊病例，住院病例数不少于总病例数的1/2，门诊病例注意严格控制可变因素。男30例，女20例。年龄最小者20岁，最大者63岁，平均年龄37岁。性别，年龄经统计学处理差异无显著性。
鼻咽癌上行转移患者（颅神经型，颅神经受侵犯和颅底骨破坏，但无颈部转移，无远处转移）10例，鼻咽癌下行转移患者（颈淋巴结广泛转移型，常有广泛全身淋巴结受累的可能）10例，鼻咽癌上下混合型转移患者10例，鼻咽癌无转移患者10例，鼻咽部慢性鼻咽炎患者10例。
1.2 疾病诊断标准 鼻咽癌颅内转移的确定，参照全国常见恶性肿瘤诊治规范 ［9］ 及MRI检查。
1.3 排弃标准 不符合上述西医诊断标准及中医证候诊断标准;合并有严重的心血管、肝、肾等疾病;精神病患者年龄在20岁以下或63岁以上，妊娠或哺乳期妇女;非湖南出生或非汉民族。
1.4 纳入标准 组织标本西医诊断标准。上行转移:鼻咽癌颅内转移。下行转移:鼻咽癌淋巴结转移。上行加下行转移:鼻咽癌颅内转移加淋巴结转移。鼻咽癌无转移。鼻咽部慢性炎组织。其他部位颅内转移活组织固定后做蜡块保存。
2 方法
2.1 免疫组织化学法观察不同鼻咽组织中或脑组织VEGF的表达
2.1.1 材料与仪器 （1）材料:①取材:符合上述标准的鼻咽部或脑组织;②试剂:A4%多聚甲醛（PFA）;B甲醇-H 2 O 2 液;C PBS:10×贮存液，1×工作液，（0.1M、0.5M、2M PBS均相应配制;D S-P封固液。E0.01M枸橼酸缓冲液;F Poly-L-Lysine;G蓝色DAB显色试剂盒（4℃保存）。H S-P免疫组化染色试剂盒（4℃保存，免冻）。（2）仪器:①BTS-20-M彩色图像显微分析系统，英国。②828型（台、手执式）PH/ISE测试仪，美国奥立成（orion）公司。③DZF-6050真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。2XZ-05型旋片式真空泵，浙江黄岩医疗器械厂。④湿盒，100片型，Boster公司。⑤XDS-1B双目显微镜，徕卡公司。
2.1.2 方法
2.1.2.1 标本取材及预处理 鼻咽部组织或脑组织标本于10%中性福尔马林液中固定24h后，取材编号放入少量伊红染色，放入全自动脱水机脱水透明浸蜡12h，然后包埋，修蜡块。连续切片4μm厚，捞3片，烤干，1片HE染色做常规对照，步骤如下:二甲苯脱蜡10min，无水乙醇2s，95%乙醇2s，80%乙醇2s，水冲洗5min，苏木素染色10min，水冲洗5min，1%盐酸酒精分化20s，返蓝10min，80%乙醇2s，90%乙醇2s，伊红2s，95%乙醇2s，95%乙醇2s，无水乙醇10s，烤干，中性树脂封片。
2.1.2.2 载玻片处理 先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗2～3次，置160℃以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。
HCl处理法:试剂:（1）1mol/L HCl;（2）DEPC水;（3）95%乙醇。步骤:（1）玻片在室温下于1mol/L的HCl中浸泡30min;（2）DEPC水中洗片;（3）95%乙醇中洗片;（4）空气中干燥;（5）重复一遍步骤1～4;（6）铝箔包好备用。
2.1.2.3 多聚赖氨酸包被玻片 （1）沾附剂:多聚赖氨酸（poly-L-Lycine，PLL）;储备液（0～5%）:PLL25mg DEPC水5ml按上述剂量充分混合，即为浓度为5mg/ml（0.5%）的PLL液。常分装成1ml液，可反复冻融，无明显影响。用前充分混合。工作液（0.01%）:0.5%PLL1ml DEPC水50ml充分混合，静止待气泡消失。（2）多聚赖氨酸包被玻片的制备方法（其它包被剂相同）:将事先准备好的经160℃以上烘烤，并冷却至室温的玻片（载片或盖片），在0.05%（也有用0.1%）的PLL液中上下浸蘸几下，分散开竖放在架子上，于空气中自然干燥，4℃备用。注意:①浸蘸时，务必使整个玻片完全浸于液体中，否则，包被不完全会产生标本脱落现象;②干燥过程中注意避免尘埃污染;③按上法处理的玻片通常可存放在一定时间（室温1月以上，4℃更长），但仍建议尽早使用。④多聚赖氨酸1mg溶于10ml灭菌的去离子水或1mmol/L的Tris-HCl缓冲液中（PH7.0），将其涂布于玻片上，待干燥后即可使用。该法包被的玻片可用于细胞涂片和切片。（3）将PLL工作液滴至盖玻片上5μl/片，用另一盖玻片以推血涂片方法推片，或用另一盖玻片紧贴于其上，相互磨擦以使两盖玻片相对的一面涂布上PLL。该法制备的玻片，只有一面是包被有PLL，故制备时，待其晾干 后，应作好记号，然后保存后备用。
2.1.2.4 微波抗原修复 微波抗原法是众所周知用于恢复福尔马林固定组织的抗原性。标准微波方法:将装有脱蜡切片的器官置于玻片温育盒中，盒中放入工作浓度的抗原修复液，盒盖稍开，并将盒置于微波炉中。将微波炉置于高档，待工作液一沸腾，立即关掉微波炉。设定微波炉功率200300W之间，加热10～15min调节功率设置，保证每20～30s开断一次，工作浴每个循环沸腾5～10s。让切片冷却20～30min，然后用蒸馏水多次冲洗。
2.1.2.5 S-P免疫组化法（S-P试剂盒Boster公司）染色步骤 另2片多聚赖氨酸包被玻片，做免疫组化进行以下免疫组化染色程序。采用免疫组化S-P法对50例初次确诊的入选患者鼻咽粘膜VEGF的表达进行了检测。一抗为nm23-H，单浓缩型兔抗人VEGF多克隆抗体，购自美国Maxim公司，即用型免疫组化超敏S-P试剂盒购自美国Maxim公司（福建福州迈新生物技术开发公司分装为VEGF工作浓度为1∶50）。将标本切4um厚石蜡切片，微波抗原修复，作免疫组织化学（SP法）染色，对照:以PBS置换抗体阳性对照，以已知VEGF阳性的鼻咽癌组织作阳性对照。步骤如下:二甲苯脱蜡6min，二甲苯脱蜡6min，二甲苯脱蜡6min，无水乙醇2s，95%乙醇2s，80%乙醇2s，水冲10min，过氧化氢6min，PBS2s，PBS2s，热修复抗原:将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH6.0），电炉加热至90℃恒温10min，室温下自然冷却后0.1M，抗原修复液Ⅰ:用抗原修复液Ⅰ进一步暴露抗原———滴加在切片上室温10min后，0.1M PBS洗涤2～3次，蒸馏水洗1次3min，PBS洗涤3次，每次5min，上机（滴加正常山羊血清50μl封闭液，室温5min，甩去多余液体，不洗。滴加适当稀释的一抗，室温1h左右，0.1M PBS洗5min×3次，滴加二抗，20℃～37℃30min。0.1M PBS洗5min×3次，滴加试剂三抗，37℃20min，0.1M PBS洗5min×4次。DAB显色:使用DAB显色试剂盒（ED1022）。取85m1蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各17滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～30min之间。PBS洗涤一次，苏木素轻度复染3～4min，1%盐酸酒精分化20s，水洗返蓝6min，60℃烤箱烤干，封片。显微镜观察。
2.1.2.6 VEGF蛋白表达指标的检测 将以上程序染色封片后的标本，逐个置于高倍显微镜（10×25）下观察，细丙浆和（或）细胞核显示棕黄色颗粒为Nm23-H1或VEGF阳性细胞。切片经由计算机免疫组化分析系统分析（软件由华东理工大学研制），每张切片在瘤内随机选取五个视野（200X），单个视野约100个细胞进行测定，取其平均值，为该例标本VEGF阳性比率（%）。方法如下，先去除背景，分别扫描阴阳性细胞面积，经计算机自动分析得出阳性比率=阳性细胞面积/阴阳性细胞面积之和（%）。阳性比率<25%为阴性（-），>25%为阳性（+）。
2.1.3 统计学方法 使用PEMS（华西医科大学统计学教研室）统计软件包对数据进行统计学处理。
3 结果
见表1。
表1 鼻咽组织VEGF表达 （略） 注: △ P<0.01， ※ P>0.05
4 讨论
血管内皮生长因子（vasocular endothelial growth factor，VEGF）是目前所知作用最强的促血管内皮生长的细胞因子。VEGF又称血管通透性因子（VPF）是一种功能强大且能产生多种效应的细胞因子 ［10］ 具有增加微血管的通透性，促进不同来源的内皮细胞分裂和血管构建，促进内皮细胞的迁移等多种作用，还可诱导u-PA、t-PA和PAI及整合素的α 3β 3 的表达。
VEGF是一个家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E以及胎盘生长因子等。VEGF的mRˉNA有五种剪接变异体:VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206分别编码121、145、165、189、206个氨基酸。由于cDNA扩增丰度中VEGF165最高，所以是在临床和动物实验中应用最多的一种VEGF单体。所有的VEGF都有疏水性的前导肽，分泌到细胞外后前导肽被切去，产生成熟的蛋白。VEGF的活性形式是借二硫键连接的同源二聚体VEGF的作用通过受体KDR/F1K1、Flt1、Flt-4介导，VEGF受体主要存在于包绕或穿过肿瘤组织的血管内皮细胞。VEGF在硫酸肝素糖蛋白的参与下与受体结合，发生自身磷酸化而启动下游信号系统发挥作用。缺氧、癌基因及抑癌基因的缺失或变异、低血糖、雌激素作用等也可促进VEGF mRNA的表达 ［11］ 。血管内皮生长因子是最重要的血管生成刺激因子之一，它通过促进肿瘤血管生成从而促进多种肿瘤的转移 ［12］ 。
低氧是肿瘤组织中普遍存在的现象 ［13］ ，近年来研究发现 ［14］ 肿瘤微环境低氧可以诱导肿瘤细胞VEGF表达增加，并认为此机制在肿瘤转移的过程中可能起重要的作用。
VEGF在体内有两种效应形式即长期效应和短期效应。VEGF可以在短期内（5min）增加血管通透性，其效应是组胺的几万倍，导致循环中大分子外渗促进细胞外纤维蛋白基质的沉积，以利于成纤维细胞及内皮细胞的迁移及增殖。肿瘤组织中的基质细胞如内皮细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞均可分泌VEGF。有人认为 ［15］ 肿瘤基质细胞产生的VEGF在肿瘤的血管形成过程中作用更关键。
本组实验结果显示鼻咽癌颅内转移组及混合转移组VEGF表达水平明显高于其他组，与其他组比（P<0.01）有统计学意义。与姜凯等 ［16］ 的报道相符。VEGF与鼻咽癌颅内转移已有很多学者对VEGF与鼻咽癌转移及预后的关系 做了大量的临床及基础研究 ［17、18］ ，亦有学者研究了VEGF与脑转移瘤的关系 ［16］ ，认为VEGF的表达水平与鼻咽癌的预后呈负相关，表达水平越高，脑转移的发生率亦越高。
血管形成过程中产生的一系列细胞因子，也是肿瘤细胞转移的温床。肿瘤转移最终能否形成，还取决于肿瘤细胞在继发部位是否能获得充足的血供。所以研究肿瘤的血管形成及血管形成与肿瘤转移的系，是预防为主和治疗肿瘤转移的十分有效的途径。
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（收稿日期:2004-06-15） （编辑元 红）
作者单位:1410007长沙湖南中医学院
2410006长沙湖南省肿瘤医院