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随着工业现代化的不断发展，肺癌的发病率也随之持续上升。根据世界卫生组织（WHO）2001年公布资料显示，在过去10年间全球癌症的发病及病死率增长了约22%，其中肺癌无论从发病数量（120万/年），还是死亡数量（110万/年）来看，均为全球最主要的癌症 ［1］ 。若仅利用现有的诊断标准和治疗方法，只有不到15%的肺癌患者可以存活，其主要原因是当肺癌患者被确诊时，65%的患者已经发展为进展期，即已错过了治疗的最佳时机，并且已经伴有全身多处转移灶。另外，还有相当多的患者死于肺癌的术后复发。因此，提高肺癌的早期检出率是迫在眉睫的需要我们解决的问题。
然而肿瘤的发生、发展是一个多阶段、多步骤、多因素参与的过程，并由一系列的遗传和遗传外的改变所引起。其中DNA的异常甲基化作为一种遗传外的改变与肿瘤的发生、发展的关系引起了越来越多的研究者的重视，已经成为分子肿瘤学研究的一个重要组成部分。本文主要对肺癌患者及高发人群痰、血浆中的抑癌基因p16启动子区的异常甲基化与肺癌早期诊断的关系做一综述。
细胞周期调控系统的失控在肿瘤发生、发展过程中起到了十分重要的作用。细胞周期素依赖的激酶的抑制物p16 ［2］ 是细胞周期调节的重要成分。这个基因编码是一个细胞周期蛋白，此蛋白抑制CDK4和CDK6的活性 ［3］ ，负向调节依赖细胞周期素D的Rb基因产物的磷酸化，使E2F不能够被释放出来，因而阻止了细胞循环从G 1 期进入S期 ［4］ 。p16基因定位于9p21，这个染色体位点在许多肿瘤和细胞系中都是高频异常的区域 ［5～7］ 。
研究表明，在32%～70%的非小细胞肺癌患者中发现有p16基因表达缺失。其失活机制主要通过四种方式:（1）p16基因突变，在0～10%的原发性非小细胞肺癌患者的特殊类型中或晚期病变中存在p16基因突变;（2）p16基因纯合性缺失，0～25%的肺癌患者中存在p16基因纯合性缺失，而且与肺癌的转移呈高度相关;（3）杂合性缺失，肺癌患者中9p21的杂合性缺失非常普遍（0～83%），在非小细胞肺癌患者中具有非常高的变异频率。（4）p16基因启动子区的异常甲基化，有报道称在15%～53%的原发性非小细胞肺癌患者中发现有p16基因启动子区的异常甲基化，并且可能与其转录缺失有关。
Chen ［8］ 发现在69%的非小细胞肺癌患者的肿瘤中至少发现有一种p16基因的改变。而在这些改变中，p16基因启动子区的异常甲基化则被认为是p16基因失活的主要事件。另外，在这些患者的痰标本中检测p16基因的异常甲基化，其检出率92%与肿瘤组织中的检出率相一致。这些 结果表明:p16基因启动子区异常甲基化是导致p16基因表达缺失的主要机制，并且其敏感性及特异性较好，因此可以作为非小细胞肺癌的潜在分子标志物。
1 p16基因与慢性吸烟者
目前，在正常吸烟人群的呼吸道中发现了几种在人类肺癌中经常出现的基因异常。其中，较常见的一种就是p16基因异常甲基化。对正常吸烟人群痰标本中的脱落细胞进行检测时，发现p16基因异常甲基化频率较高，而正常非吸烟人群痰标本中则没有发现该变化，说明这一基因改变可能与早期呼吸道肿瘤发生过程密切相关。Steven的研究 ［9］ 表明:对既往史不明的吸烟人群中33例的痰标本进行分析，其中8例的痰液DNA中检测到了p16基因异常甲基化;而3例未吸过烟的正常人通过支气管镜进行支气管上皮检测时，没有发现p16基因异常甲基化。在8例p16基因甲基化异常的人群进行细胞学检测时有3例被诊断为肺癌，分别为肺鳞癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌。其他5例未患肿瘤的吸烟者痰标本进行细胞学检查时则发现:（1）轻度不典型增生;（2）重度不典型增生，怀疑有癌变可能;（3）阴性;（4）不十分乐观;（5）鳞状化生。其中细胞学检查不十分乐观的吸烟者在1年后发展为小细胞肺癌。Kersting ［10］ 对8例有p16基因异常甲基化的吸烟者进行随访。结果3例发展为肿瘤，1例在1年后纤维支气管镜检查时确诊为肺癌并已死亡，1例发展为食管癌且伴有左主支气管狭窄，另1例在12年前患喉癌并已切除的患者在行纤维支气管镜检查后1年发展为非转移癌并且已经死亡。这3例之前在纤维支气管镜检查时都发现有p16基因异常甲基化。肺癌患者中大约有一半是长年吸烟者。尽管戒烟可以减小患肺癌的危险性，但吸烟积累下来的患病率却仍然很高。如果一位75岁的老人在50岁时戒烟，患肺癌的危险性仍然是非吸烟者的6倍多。这主要是由于吸烟人群的支气管上皮发生分子生物学改变而引起的。吸烟者戒烟后，其支气管上皮中的p16基因异常甲基化仍然存在。但这些改变并不是完全不可改变的，吸烟人群肺部的病变将会随戒烟而逐渐缩小。因此，研究p16基因异常甲基化与这些可逆转病变部位的关系是非常有意义的。如果p16基因异常甲基化也是可逆转的话，那么检测痰中p16基因的甲基化水平将会成为监测吸烟等肺癌高发人群的一种有效手段。
2 痰中p16基因异常甲基化与肺癌
p16基因启动子区的异常甲基化是肺癌患者肿瘤发生过程中的一起早期事件。在56.8%的Ⅰ期和Ⅱ期肺癌患者中发现有p16基因异常甲基化，而在这些患者中61.9%的患者痰标本在临床诊断前1～3个月即可发现有改变 ［8］ 。Kim ［11］ 等的结果显示:鳞癌p16基因的甲基化比率（41%）与腺癌的（22%）差异有显著性（P=0.03）。并且p16甲基化与吸烟的数量（P=0.007）、吸烟持续的时间（P=0.0009）明显相关，和戒烟持续的时间成负相关（P=0.03）。 近来的研究更进一步证明，在细胞周期调控中具有重要意义的抑癌基因p16启动子区异常甲基化是非小细胞肺癌中，尤其是肺鳞癌发生中的一件早期、高频事件。最近的一项免疫组化结果显示:p16基因在50.0%的非小细胞肺癌患者肿瘤中表达缺失。在56.7%的非小细胞肺癌患者的肿瘤DNA中发现有p16基因异常甲基化，而在这些患者相应的痰标本中，其检出率与肿瘤标本中的一致性高达92%。另外，在非小细胞肺癌中还有一个经常由于启动子区异常甲基化而失活的抑癌基因MGMT。不但在100%的肺鳞癌患者的痰标本中至少可以检测出p16基因和MGMT中的一种基因启动子区异常甲基化，而且在他们肿瘤确诊前的5～35个月的痰标本中就检测出了该变化 ［12］ 。 因此，研究者们认为p16基因异常甲基化可能与非小细胞肺癌患者，尤其是肺鳞癌患者癌症的发生、发展密切相关。人类肺鳞癌被认为是经过一系列的形态学改变而形成的:首先足基底细胞增生，然后导致鳞状细胞化生，接下来发生原位癌，最后导致鳞癌。而在大多数非小细胞肺癌患者的肿瘤组织本身都发现有p16基因异常甲基化，说明p16基因异常甲基化不只是由于特定上皮损害而引发的偶然事件，而可能是由于肿瘤细胞的扩张而引起的。 Merlo ［13］ 曾经报道一个已经被诊断为小细胞肺癌的患者在进行痰标本检测时发现其痰中p16基因出现了异常甲基化，理论上，p16基因失活很少发生在小细胞肺癌的患者身上。然而，在该患者痰中查出p16基因异常甲基化2年后，被确诊还患有非小细胞肺癌。
3 血浆中p16基因异常甲基化与肺癌
在正常人血中存在着极少量的DNA。有研究表明:肿瘤DNA同时也被释放到人的血浆中。肿瘤患者血浆中的DNA是正常人血浆中游离DNA的4倍 ［14］ 。因此，人们可以在肿瘤患者的血浆中检测其某些基因改变。例如:在绝大多数结肠癌中出现的hMIH1启动子区的异常甲基化和在子宫内膜癌中出现的微卫星改变都可以在其患者相应的血浆中检测出来 ［15］ ;在90%的前列腺癌中出现的GSTP1异常甲基化也可以在血浆中出现 ［16］ 。
在Esteller的一项研究 ［17］ 中:73%肺癌患者的肿瘤DNA与其相对应的血浆DNA同时发生了p16基因异常甲基化。最近的一项研究显示:在73.3%的非小细胞肺癌患者的血浆中检测到了p16基因异常甲基化，在79.3%与之相对应的肿瘤标本中检测到了该变化。在血浆及与之相对应的肿瘤组织检出率的一致性为87.7%。在不同的肿瘤临床分期中，血浆中p16基因异常甲基化的频率与其在肿瘤中发生的频率大致相等。Qian An ［18］ 等研究了p16基因在非小细胞肺癌的肿瘤组织和其对应的血浆标本中的异常甲基化状况，发现在肿瘤组织标本中其甲基化的频率是79.3%（73/92），而在对应的血浆标本中，其甲基化的频率是73.3%（77/105），在发生甲基化的肿瘤组织对应的血浆标本中，p16甲基化的检出率是87.7%（64/73）。 另外，血浆中DNA的p16基因异常甲基化的特殊光谱可以为人们了解原发肿瘤的生物行为提供线索。因此，检测血浆中DNA的p16基因异常甲基化将为人们提供一种 新的监测肺癌发生、发展过程的手段。
4 p16基因异常甲基化与肺癌患者的预后
存在p16基因异常甲基化的肺癌患者预后往往比那些没有p16基因改变的肺癌患者预后要差，尤其是在肺腺癌中为甚。Kim ［11］ 认为p16基因甲基化可以作为预测腺癌Ⅰ期患者存活率的一个独立风险因子。肺腺癌患者在原发性肿瘤还很小的时候就可能已经发生了远处转移，而p16基因异常甲基化可以增加肺腺癌患者发生远处转移的几率。另外，Ⅲ期和Ⅳ期肿瘤患者中的p16基因表达缺失和启动子区的异常甲基化可能与肿瘤的进展具有一定相关性。在Huang的研究 ［19］ 中，存在p16基因表达缺失的Ⅰ期肺鳞癌患者的5年存活率仅为51.3%，而Ⅰ期肺鳞癌患者的5年存活率通常可以达到75%。另一方面，没有p16基因异常改变的Ⅰ期肺鳞癌患者在手术切除后几乎不发生复发，然而，若伴有p16基因表达缺失的肺鳞癌患者在手术后，尽管其可能仅处于Ⅰ期，但必须进行术后化疗，只有这样才有可能提高其存活率。研究发现，p16基因的甲基化在肺癌中是一个早期事件，可作为一个潜在的肺癌早期诊断的生物标记物 ［20］ 。2000年Willlam A Palmisano ［12］ 等利用MSP方法检测了确诊的肺癌患者三年前的痰标本中p16、MGMT基因的甲基化，发现二个基因的甲基化联合与最终的诊断结果的吻合率是100%。由于在肝癌 ［21］ 、食管鳞癌 ［22］ 、肺癌 ［18］ 患者的血浆或血清、膀胱癌患者的尿 ［23］ 中也检测到了p16基因的甲基化，这些结果提示在痰、血浆或血清中检测p16基因的甲基化有可能成为临床上无创的诊断多种肿瘤的手段之一。 综上所述，通过对肺癌高发人群痰和血浆中的p16基因启动子区的异常甲基化进行检测，不但可以提高肺癌的早期诊断率，而且可以预防肺癌的发生。但是由于人们对甲基化的分子机制和肿瘤发病机制的认识还远远不够，要把甲基化能够真正的应用于临床，我们还有很长的路要走。相信随着科技的不断发展，新的分子标志物将会层出不穷，人类战胜肿瘤的日子将指日可待!
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（编辑吴 莹）
基金项目:辽宁省教委科技资助项目（编号:202203248）
作者单位:116027辽宁大连医科大学组织学与胚胎学教研室（ △ 通 讯作者）