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【摘要】 目的 了解本地区乙型肝炎病毒（HBV）流行株前C（PreC）基因的变异，为临床提供诊疗信息。方法 通过设计2条特异性引物进行PCR扩增病人血清中PreC基因序列，回收PCR产物直接进行DNA测序和比对分析。结果 PreC变异主要集中在nt 1896位G→A。结论 PreC变异可使HBeAg阴转。
【关键词】 乙型肝炎病毒；变异；前C基因
A study on the mutations of precore gene of hepatitis B virus genome in e antigen-negative sera
GUO Long-hua，HUANG Xian-zhang，ZHUANG Jun-hua.
Clinical Laboratory，Ersha Island Branch，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510105，China
【Abstract】 Objective To investigate the mutations of precore gene in the e antigen-negative sera of patients with hepatitis B virus（HBV） infection and provide information for diagnosis and remedy of the diseases.Methods Precore gene were amplified by heminested-PCR from e antigen- negative sera and e antigen -postive sera，and the PCR products were sequenced，and the sequences were analysed.Results There was a hot point mutation in nucleotide position 1896G→A in precore gene.Conclusion The mutations in precore gene an cause e antigen sero conversion.
【Key words】 hepatitis B virus;mutation;precore gene
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是不完全双链环状DNA病毒，基因组全长约3.2kb，为目前已知对人类致病的最小DNA病毒。HBV复制过程中要经过逆转录，由于逆转录酶缺乏有效的碱基校对功能，故HBV基因组比一般DNA病毒易发生变异。这给疾病的预防、诊断、治疗和预后带来新的问题。有关HBV基因组的变异，近些年来一直是人们研究的热点。
过去认为乙肝病毒e抗原（HBeAg）阴转，表明病情向好的方面发展。研究证明，如果体内还有HBV在复制，HBeAg阴转往往是HBV在体内发生变异的结果，易使疾病慢性化。HBV PreC基因定位于乙肝病毒基因组nt1814-1900，PreC由于突变，提前出现终止子，HBeAg合成提前终止，影响干扰素疗效［1］。PreC是高变区，研究PreC的变异具有重要的临床意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血清标本
来源于我院门诊和住院病人。
1.1.2 主要仪器
Roche公司Light Cycler型荧光定量PCR仪、飞鸽牌TGL-16B台式高速离心机。
1.1.3 主要试剂
广州达安基因公司HBV DNA荧光PCR定量检测试剂盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（国产），裂解液（自配）。Taq DNA酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、PCR产物直接回收试剂盒和DNA Marker（北京天为时代公司）。
1.1.4 引物
参照GenBank中的HBV基因组序列，用Primer Premier 5.0软件设计2条特异性引物（半巢式PCR）：正义引物P1:5′-GAC TCT CAG CAA TGT CAA CG-3′（nt 1669-1688）；反义引物P2:5′-TCA TCA ACT CAC CCC AAC AC-3′（nt 2099-2080）；由北京三博远志生物公司合成。设计PCR终产物431bp。
1.2 方法
1.2.1 标本采集
收集30例HBeAg阴性标本（HBV DNA含量3.0×103~3.1×105copies/ml）和5例HBeAg阳性标本（HBV DNA含量都高于5×105copies/ml，用于对照）。
1.2.2 HBV DNA的提取
方法参照文献［2］。
1.2.3 PCR扩增
10×缓冲液5μl，P1、P2（5μmol/L）各2μl，dNTP（10mmol/L）1μl，Taq DNA酶（1U/μl）1μl，MgCl2（25 mmol/L）3μl，模板6μl，ddH2O 30μl。加石蜡油30μl，94℃ 5min。然后94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min共循环35次，72℃延伸5min。
1.2.4 结果的观察及回收
取第二轮PCR产物在1.2%琼脂凝胶（含EB）上电泳，观察结果。用试剂盒直接回收剩余PCR产物。回收的PCR产物送北京三博远志生物公司用引物P1、P2分别进行正反测序。
2 结果
2.1 PCR产物电泳结果
见图1。设计产物长431bp，电泳结果与预期一致。
2.2 用DNAMAN软件对PreC序列进行比对分析
本次实验共发生4例插入突变。1例标本nt 1825后插入一个T，这个位点的插入可同时使X蛋白、HBeAg合成发生移码突变导致X蛋白C端延长20aa，HBeAg发生阴转。3例标本nt 1838后插入A，可使HBeAg合成时移码，HBeAg阴转。
3例标本nt 1814位A→C，使PreC基因起始密码子ATG→CTG，导致HBeAg阴转。如果nt 1896位G→A，使第28位密码子TGG→TAG（终止子），翻译提前终止，这是世界各地报道最多的变异位点，此位点本地变异率为40%（12/30），与广西的报道［3］基本持平。PreC基因其他位点变异基本是同义突变，不会使HBeAg阴转。HBeAg阳性标本PreC未见突变。
3 讨论
HBV基因突变可在三个水平上影响HBeAg合成。基本核心启动子（BCP）突变属于在转录水平影响HBeAg合成。PreC基因提前出现终止子、启始密码子变异和移码突变，都可在翻译水平上影响HBeAg的合成。其中最常见的是nt 1896位G→A。如果nt 1862位G→T使第17位密码子由缬氨酸（valine，V）变成苯丙氨酸（phenylalanine，F），HBeAg前体信号肽就不能被切除，从而影响HBeAg分泌，属于翻译后水平上的影响。nt 1862位G→T变异易引发重症肝炎［4］，本次研究未发现此种变异。HBeAg可表达于肝细胞表面，成为细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的靶抗原，或通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）以清除HBeAg感染的肝细胞。如果体内有HBV在复制，HBeAg阴转，反而有助于HBV免疫逃逸。HBeAg阴性的HBV感染者应引起人们重视。由于血液中的HBeAg可以干扰或抑制CTL对肝细胞膜上的HBcAg的攻击，故HBeAg的减少可使CTL对肝细胞膜上的HBcAg攻击得更为强烈，从而引起严重的肝损害，导致重症肝炎。
【参考文献】
1 Bayraktar Y，Koseoglu A，Temizer A，et al.Relationship between the serum alamine aminotransferase level at the end of interferon treatment and histologic changes in wild type and precore mutant hepatitis B virus infections.J Viral Hepat，1996，3（3）:137-142.
2 郭龙华，董长垣，高婧，等.一种从血清标本中快速提取HBV DNA方法的建立.武汉大学学报（医学版），2005，26:344-346.
3 方钟燎，庄辉，杨进业，等.HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清HBV前C区的序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，2002，16（1）: 90.
4 林裕龙，彭永正，冯桂湘，等.乙型肝炎病毒前C信号肽酶裂解位点变异对HBeAg表达的影响.中华检验医学杂志，2004，27:17-19.
作者单位： 510105 广东广州，广东省中医院二沙岛分院检验科