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【摘要】 目的内皮前体细胞(endothelial progenitor cells， EPCs)是实体肿瘤血管新生及肿瘤生长的重要参与细胞，而手术有动员EPCs作用。本研究观察手术对EPCs数量及肿瘤生长的影响。方法Wistar大鼠行腋窝皮下接种Walker 256肉瘤细胞。手术前和手术后14天，测量荷瘤鼠肿瘤大小，流式细胞术分析外周血EPCs数量及ELISA检测血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平。结果Wistar大鼠在接种Walker 256细胞后，按肿瘤大小分组发现，肿瘤生长较快组CD34+细胞数量增加明显(P<0.05)，KDR+、CD34+KDR+细胞数量虽有增加但不明显。手术后，KDR+ 、CD34+KDR+细胞数量增加(P<0.05)，但肿瘤大小无明显差异。此外，未观察到VEGF在肿瘤的生长及手术动员EPCs中的变化。结论干细胞与肿瘤生长有一定相关性。手术能动员EPCs，但在术后短期内，所动员的EPCs对肿瘤生长影响不明显，长期影响有待进一步研究。
【关键词】 血管内皮前体细胞;血管内皮生长因子;实体肿瘤;手术
ObjectiveEndothelial progenitor cells (EPCs) are important cells involving in solid tumor angiogenesis and tumor growth. Moreover，EPCs can be mobilized by surgery. In this study，we observed effect of surgery on tumor growth and EPCs number in tumor bearing rats.MethodsWistar rats inoculated under the armpit with walker 256 sarcoma cancer cell line. The tumor size，the number of EPCs and vascular endothelial growth factor (VEGF) level in serum of rats in each group were observed by flow cytometry and ELISA before and after surgery 14d.ResultsAfter Wistar rats inoculated with walker 256 cells，we found that tumor growing faster group increased significantly in the number of CD34+ cells (P<0.05) and the number of KDR+，CD34+ KDR+ cells also increased but had not significantly which grouped according to tumor size. After surgery，the number of KDR+，CD34+ KDR+ cells increased (P<0.05) and there was no significant change in tumor size. Moreover，the effect of VEGF was not observed in tumor growth and mobilization of EPCs with surgery.ConclusionEPCs may be involved in tumor growth and surgery can mobilize EPCs into blood. However， in the short term after surgery，the effect of mobilized EPCs has no significant on tumor growth and should be studied further for long-term effects.
[Key words]endothelial progenitor cells;vascular endothelial growth factor;solid tumor;surgery
实体肿瘤的生长依赖于肿瘤新生血管的形成。多个研究表明，内皮前体细胞(endothelial progenitor cells， EPCs)在肿瘤血管新生中起重要作用[1~4]。增加EPCs在血循环中的水平，能加速肿瘤的生长[5]。多种因素影响血循环中EPCs数量，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)参与造血干细胞和EPCs的动员与募集等过程[6,7]，而且，最近研究发现，手术能动员EPCs进入外周血循环中[8]，但手术对肿瘤生长的影响研究较少。本研究选用Wistar大鼠接种Walker 256肉瘤细胞后,测定荷瘤大鼠肿瘤生长情况，给予不同手术后，检测各组肿瘤大小、外周血EPCs数量及血清中VEGF水平。探讨手术动员EPCs的效果，以及这种效果对肿瘤生长的影响。
1材料与方法
1.1试剂RPMI 1640培养液、胎牛血清和青霉素-链霉素双抗购自德国PAA公司，生物素化抗大鼠CD34单克隆抗体购自美国R&D systems公司，兔抗大鼠VEGF 受体2(VEGFR2，亦称KDR)单克隆抗体购自美国Abcam公司，APC标记的抗生物素蛋白链菌素和FITC标记的羊抗兔Ig购自美国BD pharmingen公司，7-AAD购自美国Sigma公司。
1.2Walker 256细胞培养Walker 256细胞(中国科学院上海细胞所)于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640完全培养液，37℃，5%CO2，100 %湿度，25mm2培养瓶内培养。贴壁长满至瓶底80%时传代。取对数生长期的细胞进行实验。
1.3实验动物Wistar雄性大鼠，体质量(200±20)g，由中国科学院上海动物实验中心提供，合格证号为SYXK(沪)2009-0082。Walker 256细胞经大鼠腹腔体内传代，形成稳定的移植瘤模型，体内第3代移植瘤为瘤种。取瘤种的腹腔积液接种于大鼠腋窝皮下，每只动物接种0.4ml，进行大鼠荷瘤造模。造模第6天后，选瘤块直径1.0 cm左右的荷瘤模型大鼠，共30只。
1.4动物实验荷瘤模型大鼠随机分为对照组10只、小手术组10只和大手术组10只。分组后对照组单纯麻醉;小手术组麻醉后腹部表皮切开1.0 cm并缝合;大手术组麻醉后摘除一侧睾丸。苏醒后按常规饲养。手术第0和14天，分别测量各组动物的体质量、肿瘤体积，并尾静脉采集外周抗凝血(BD公司，EDTA抗凝)。
1.5外周血白细胞计数和分类制备细胞分布均匀的血涂片，待干，瑞氏染色后，油镜视野下计数100个白细胞，按其形态特征进行分类计数，获得单个核细胞占白细胞总数的比值。用计数板计数外周血每毫升中的白细胞数量，获得每毫升外周血中单个核细胞的绝对数量。
1.6抗体标记将大鼠外周EDTA抗凝血移至离心管，700g 4℃离心20 min，各样本的血浆分别收集至另一appendof管中，-20℃冻存备用。细胞沉淀重悬至2ml 含0.5%(w/v)BSA及1.5mM EDTA的冷的PBS中，700g 4℃离心20min，然后弃上清，细胞沉淀再重悬至1ml 含0.5%(w/v)BSA及1.5mM EDTA的冷的PBS中，先用生物素化抗大鼠CD34单克隆抗体进行CD34标记，4℃孵育40min，PBS洗1遍后再加入CD34二抗及KDR抗体(预先将一抗与二抗混匀孵育)，4℃孵育40min。CD34和KDR标记的同时均做同型对照。红细胞裂解后，加入7-AAD(终浓度为1μg/ml)，室温孵育15min。
1.7流式细胞术检测FACS Calibur(美国BD公司)的发射激光由氩离子激光器产生，功率为15mW，激发光波长为488nm。FITC和APC荧光分别设在FL-1或FL-4荧光通道上，测定前用校准荧光微球校正仪器，每测定管收集100000个细胞，采用Cell Quest软件进行结果分析。
1.8外周血EPC绝对数量计算根据外周每毫升血中单个核细胞绝对数，以及流式分析获得的外周血CD34+、KDR+及CD34+KDR+细胞在单个核细胞中的比值，分别计算出外周每毫升血中CD34+、KDR+和CD34+KDR+细胞绝对数。
1.9ELISA法检测VEGF含量取收集的血清，按试剂盒说明书(上海明睿生物技术有限公司)进行VEGF含量检测。先按说明书配制标准品共8个浓度，然后向反应孔加入标本或不同浓度的标准品，同时设空白孔，均设复孔。36℃孵育90min后，洗板5次;再加生物素化抗体VEGF，36℃孵育60min后，洗板5次;然后加酶结合底物，36℃避光孵育30min，洗板5次;然后加显色底物，36℃避光孵育15min后，中止反应。混匀后，用酶标仪(CK-21，Thermo，美国)测量OD值，波长为450nM。
1.10统计方法使用SPSS 11.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，组间比较用单因素方差分析。
2结果
2.1荷瘤大鼠外周血EPCs数量对肿瘤生长的影响CD34和KDR是EPCs的重要膜表面标志，EPCs早期表达CD34，晚期表达KDR。在荷瘤大鼠中，按肿瘤体积大小将动物分成两组，发现与肿瘤体积较小组相比，肿瘤体积较大组的CD34+细胞数量增多(P=0.027)，KDR+ 、CD34+KDR+细胞数量增多，但差异无显著性。VEGF是血管新生的重要细胞因子，但本实验中，虽然大肿瘤组与小肿瘤组相比，外周血VEGF含量升高，但该差异无显著性(见表1)。表1荷瘤大鼠外周血EPC数量对肿瘤生长的影响
2.2手术对荷瘤大鼠肿瘤生长的影响手术后，与对照组相比，小手术组和大手术组的肿瘤体积没有明显变化(见表2)。表2手术对荷瘤大鼠肿瘤生长的影响
2.3手术对荷瘤大鼠外周血EPC数量的影响手术后，与对照组相比，大手术组的KDR+细胞和CD34+KDR+细胞的数量有明显增加(P<0.05)，且大手术组的KDR+细胞比小手术组明显增加(P<0.05);大手术组的CD34+细胞的数量有增加，但差异无显著性(见表3)。表3手术对荷瘤大鼠外周血EPC数量的影响
2.4手术对荷瘤大鼠外周血VEGF含量的影响荷瘤大鼠外周血中含有少量的VEGF，随着荷瘤时间的延长，外周血中VEGF含量都有明显增高(P<0.01)。手术后14天，检测各组荷瘤大鼠外周血中VEGF的含量，结果表明手术对其没有影响(见表4)。表2手术对荷瘤大鼠外周血VEGF含量的影响
3讨论
本研究选用Wistar大鼠接种Walker 256肉瘤细胞后,测定载瘤大鼠肿瘤生长情况，给予手术后，检测不同组别肿瘤大小、EPCs数量及VEGF水平，结果发现：Wister大鼠在接种Walker 256细胞后，按肿瘤大小分组发现，肿瘤生长较快组CD34+细胞数量增加明显， KDR+ 、CD34+KDR+细胞数量虽有增加但不明显。手术后，KDR+ 、CD34+KDR+细胞数量增加，但肿瘤大小无明显改变。另外，未观察到VEGF在肿瘤的生长及手术动员EPCs中的变化。本研究结果表明，EPCs可能参与肿瘤生长，手术能动员EPCs，但在术后短期内，所动员的EPCs对肿瘤生长影响不明显，长期影响有待进一步研究。新血管形成在肿瘤的发生、发展和转移中占有重要地位，早期研究就已发现实体肿瘤在生长到直径超过1~2mm以后，需要通过形成新血管才能得以生存[9]。EPCs是1997年Asahara 等首次发现的，在体内能参与新血管生成的前体细胞，其表面特征性地表达CD34、血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor VEGF receptor 2，VEGFR2，又称KDR)，在早期主要表达CD34，在晚期主要表达KDR[10,11]。肿瘤组织可分泌一些因子刺激骨髓增加EPCs的生成，同时分泌因子动员生成的EPCs入外周血，募集其到肿瘤局部，使之在肿瘤局部富集并参与新的血管形成[1,2]。本研究将Walker 256肉瘤细胞种于wistar大鼠腋窝皮下，发现肿瘤生长较快的大鼠外周血中CD34+细胞数量明显增加，这提示早期阶段的EPCs可能与肿瘤生长有关。多种因素动员EPCs到血循环参与血管新生。其中细胞因子是常见的动员因素，如诱导动员红细胞或白细胞入血的粒-单集落刺激因子(GM-CSF)和粒集落刺激因子(G-CSF)，能影响EPCs的动员;VEGF能上调SDF-1和SDF-1受体，SDF-1是EPCs趋化因子，能招募EPCs移向血管新生部位[12,13]。最近研究发现，手术能动员EPCs入血。Coden等发现实验小鼠开腹手术48h后，与麻醉对照组比较，血循环中EPCs数量增加10余倍，VEGF增加7倍[14]。我们将荷瘤的大鼠进行手术，结果发现，与对照组相比，大手术组的大鼠外周血中的KDR+细胞和CD34+KDR+细胞的数量有明显增加(P=0.004和P=0.04)，而且，与小手术组相比，大手术组的KDR+细胞数量增加更明显，而CD34+细胞的数量增加不明显，这表明手术可刺激大鼠外周血中晚期阶段的EPCs数量增加。另外，虽然在本研究中，随着荷瘤时间的延长，VEGF含量明显增加(P<0.01)，但手术后，三组的VEGF含量差别不大，这提示手术动员EPCs可能与VEGF无关。手术切除术是治疗实体瘤的主要手段，而残余的肿瘤细胞是肿瘤复发的重要因素[15]。鉴于EPC在出生后血管形成中的重要作用，实体瘤的生长又强烈依赖于新血管形成，而手术能动员EPCs入血，那么，手术动员的EPCs是否参与肿瘤生长?本文观察了手术后肿瘤大小，结果发现与对照组相比，小手术组和大手术组的肿瘤体积没有明显变化。结果的可能原因之一是，手术会造成创伤，从而导致血管受损。手术动员来的晚期阶段的EPCs在早期可能主要用于伤口的修复，而不是发挥参与肿瘤血管新生的作用，从而促进肿瘤的生长。另一个可能原因是因为观察时间过短，尚不能看到EPCs参与肿瘤血管新生的作用。综上所述，手术能动员荷瘤大鼠的EPCs入血，但不影响VEGF水平，未观察到动员的EPCs与肿瘤生长的相关性。在以后进一步的研究中，需要延长手术后的观察时间，同时需扩大样本，进一步研究手术动员的EPCs对肿瘤生长的影响及其机制。
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