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关键词 环氧合酶-2 子宫内膜异位症 信使RNA 原位杂交
Detection of COX-2mRNAs in endometriosis tissues by using in situ hybridization
Chen Biliang，Fan Yang，Cai Guoqing，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology，Xijing Hospital，
the Fourth Military Medical University，Xi’an710033.
【Abstract】 Objective To investigate the expressions of mRNA of cyclooxygenase-2（COX-2）in enˉdometriosis and study the role of COX-2in the pathogenesis of endometriosis.Methods Endometrium specimens were obtained from38cases of endometriosis and35normal uterus for control.Expression of mRNAs of COX-2in these paraffin embraced specimens was examined by in situ hybridization technique with specific cDNA probes.Results Expression of mRNA of COX-2in endometriosis were abviously incread proliferative phase（3.11±0.56），sevretoˉry phase（3.05±0.41），which were significant higher compared with normal controls（P<0.001）.There was no difˉference between proliferative and secretory endometrium of endometriosis.Conclusion The increased expressions of mRNAs of COX-2in endometriosis may be one of pathogenesis of endometiosis，and advanced research to COX-2will provide the new target for therapy of endometriosis.
Key words cyclooxygenase-2 endometriosis mRNA hybridization in situ
环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是炎症过程中一个重要的诱导酶，炎症过程中前列腺素的产生主要由它来催化合成，而炎性前列腺素（prostaglandins，PG）则被认为是促血管生成原。子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）是现今国内外妇产科的常见病和多发病，其发病率逐年上升，关于其发病机制至今尚不清楚。新近有研究表明，高表达的COX-2可能是导致EMs的发病机制，它参与了EMs的血管形成，引起痛经、不孕 ［1］ 。我们用原位杂交的方法检测COX-2在EMs组织中的表达情况，探讨COX-2在EMs发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料 取第四军医大学西京医院妇产科2002年12月～2003年6月手术切除且病理确诊为子宫内膜异位症组织38例，术中进行AFS（American Fertility Society，美国生育协会）分期，Ⅰ期2例，Ⅱ期11例，Ⅲ期20例，Ⅳ期5例;其中增殖期17例，分泌期21例;年龄19～47（平均39.5）岁。组织块经多聚甲醛（含1ml/L DEPC）固定后，石蜡包埋，于无核酶环境中4μm连续切片，以备杂交。另取同期因各种原因切除子宫、病理诊断内膜正常的对照子宫内膜35例，增殖期19例，分泌期16例;年龄21～57（平均40.6）岁，标本组织处理方法同上。各组之间年龄分布无差异（P>0.05）。所有纳入实验患者术前3个月内无服用激素史。COX-2原位杂交试剂盒均由武汉博士得生物工程公司购买，探针寡核苷酸序列为:5′-ATGTATGAGTˉGTGGGATTTGACCAGTATAA-3′。
1.2 COX-2mRNA检测 实验步骤严格按试剂盒说明书进行，实验所用溶液均加入1ml/L DEPC灭活RNA酶，8h后高压灭菌备用，整个实验过程严格在无核酶环境下进行，防止核酶污染造成假阴性结果。用不含探针的PBS溶液代替杂交液作为染色的阴性对照，用已知COX-2mRNA染色阳性的肝癌组织切片分别作为二者的阳性对照。
1.3 结果判断 高倍显微镜（10×40）下观察细胞着色情况，阳性细胞仅在胞核表达，呈棕黄色。参照文献 ［2］ 免疫组织化学半定量评分标准:每张切片任意选5个视野，观察其阳性细胞胞浆表达强度，无表达为阴性（0分）、阳性颗粒呈浅黄色为可疑阳性（1分）、浅棕色为弱阳性（2分）、棕黄色为阳性（3分）、棕褐色为强阳性（4分）。计算阳性细胞百分数（5个视野的平均数），无表达为阴性（0分）、1%～15%为可疑阳性（1分）、16%～50%为弱阳性（2分）、51%～85%为阳性（3分）、86%～100%为强阳性（4分）。按公式（阳性细胞表达强度×阳性细胞百分数） 1/2 计算出该标本的阳性指数。
1.4 统计学方法 采用SPSS10.0统计学软件，结果用ˉx±s表示，采用t检验方法。P<0.05为有统计学意义。
2 结果
COX-2mRNA的表达COX-2在EMs组中以阳性或强阳性表达为主，棕黄色颗粒集中于腺细胞的胞质、核膜等部位，胞核内少量，与对照组相比有明显差异（t=7.49，P<0.001）。分别比较EMs组、对照组处于增殖期、分泌期的标本，发现COX-2mRNA在增殖期表达稍高，但无明显差异（鉴于对照组阴性染色较多，苏木精复染后进行细胞计数）。见图1。
表1 COX-2mRNA在EMs组、正常对照组的表达
注:与正常对照组相比， b P<0.001; △ 与同组分泌期相比差异无显著性（t=0.278，P=0.783）; ▲ 与同组分泌期相比差异无显著性（t=0.396，P=0.694）
3 讨论
3.1 氧合酶的结构与功能 环氧合酶是前列腺素合成过程中的重要限速酶，COX-1基因位于染色体9q32-33.3上，序列跨度为22kb，由11个外显子和10个内含子组成，其mRNA转录产物为2.7kb。COX-2基因则位于染色体1q25.2-25.3上，其外显子和内含子组成与COX-1相似，含10个外显子，约8.3kb。其mRNA转录产物为4.5kb。但是，它们在表达调控及定位分布等方面存在着明显的不同:COX-1被认为是“看家基因”，在大多数正常组织中都呈稳定的表达，维持正常的生理功能，如保护胃粘膜、维持肾脏血流等;而COX-2被认为是“快速反应基因”，仅在细胞受到刺激时迅速从头合成，参与多种病理生理过程，包括炎症过程及肿瘤的发生发展，静息时并不表达。COX-2表达的调控主要为在转录水平的调控，即细胞受到细胞内外的各种刺激后，经过一系列的信号转导促进COX-2转录，诱导COX-2的表达。
3.2 COX-2在EMs组织中的表达 有研究证实，不论是EMs的在位内膜还是异位内膜都有COX-2的表达，而且异位内膜的COX-2的蛋白水平及mRNA水平均高于在位内膜 ［3］ 。本研究中COX-2在EMs组织中的表达明显高于正常对照组（t=10.270，P<0.001），且增殖期与分泌期无明显差异（t=0.196，P=0.846）。说明COX-2在EMs发病中起重要作用。
3.3 COX-2在EMs发病机制的探讨 （1）EMs可能是一种自身免疫性疾病，在患者异位病灶、外周血和腹腔液中出现各种非器官特异性自身抗体，如抗多核苷酸类、抗组蛋白及抗磷脂、心脂类抗体以及特异性自身抗体———如抗子宫内膜抗体和卵巢抗体，抗子宫内膜抗体对EMs的发展及不孕有重要作用。去除病灶，抗体明显减少。这些自身抗体， 特别是抗子宫内膜抗体诱导COX-2在子宫内膜组织的高表达 ［3］ ，高表达的COX-2抑制机体的免疫监督，造成免疫功能紊乱，使内膜细胞在异位种植、生长，促使EMs的发生;反之，免疫功能的异常又可刺激自身抗体的产生，进一步加重EMs的病变。（2）细胞因子与EMs密切相关。各种细胞因子如IL-1、IL-2、bFGF等，是由包括巨噬细胞的免疫细胞分泌的，可诱导COX-2的表达 ［4］ ，而且已证明，COX-2可能与炎症及肿瘤的新生血管形成有关 ［5］ 。所以有学者推测，COX-2参与血管生成，与血管生成因子密切相关。有资料证实，COX-2的确可使肿瘤中的VEGF表达上调，抑制COX-2则可抑制VEGF的表达 ［6，7］ 。我们用免疫组化方法检测EMs中COX-2、VEGF的表达，发现二者存在表达相关性。COX-2可能是通过下列机制参与了血管的生成，如巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等被一些细胞因子如IL-1、bFGF激活后，可刺激MAPK、NF-κB、PKC等激酶的产生，然后经过一系列的转导途径上调COX-2的表达 ［8，9］ ，从而促使PG（PGE 1 、PGE 2 和15d-PGJ）合成的增加，其后进一步作用于相关的受体，如EP2、EP4及PPARγ等，通过EP/cAMP等途径激活各种细胞内激酶，如cAMP可激活PKA;还可通过结合一些小G蛋白的交换因子，激活Ras蛋白的活性，并可进一步激活MAPK通路等;或经过核受体直