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protein in rat brain after MCAO and reperfusion
Jiao Jianling，Lai Xinsheng，Zhang Jiawei，et al.
Medical School，Jinan University，Guangzhou510632.
【Abstract】 Objective To study the influence of electric-acupuncture on expression of C-fos protein in rat brain after MCAO and reperfusion.Methods The middle cerebral artery occlusion（MCAO）model and SPC were used.Results The C-fos expression rate of the sham-operated group:1.12±0.74;The C-fos expression rate of the ischemia group:17.15±2.76;The C-fos expression rate of the electric-acupuncture group:11.32±1.97.The C-fos expression of the ischemia group compared with the sham-operated group increases（P<0.01）;The C-fos expression of electric-acupuncture group compared with the ischemia group decreased（P<0.05）.Conclusion Loˉcal cerebral ischemia results in increase of C-fos expression，while electric-acupuncture can suppress C-fos exˉpression obviously.
Key words electric-acupuncture cerebral ischemia C-fos protein
原癌基因是生命科学的一项重大发现，当今对原癌基因的研究已远远超出肿瘤学这一领域。近几年的研究
表明，脑缺血可诱导一种立即早期基因（C-fos原癌基因）在脑组织短暂而迅速的表达 ［1～3］ ，它与脑缺血后神经细胞中信息传递及其生存或死亡有密切关系 ［4］ ，临床实践证明，针刺治疗缺血性脑血管病的疗效是肯定的 ［5］ 。本实验采用免疫组织化学法研究电针对局脑缺血再灌注大鼠脑组织中C-fos蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及急性局脑缺血模型制备 ［6～9］ 选用SD大鼠，雌雄随机，用普通饲料喂养，室温22℃～25℃，湿度65%～80%。取4-0单尼龙线50mm，一端加热使成为光滑球面，酒精清洁后置生理盐水中备用。
大鼠用10%水合氯醛（0.35ml/100g体重）腹腔注射麻醉。麻醉后大鼠仰卧手术台上，经正中切口，分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。分离ICA主干至颞额动脉（PPA），结扎PPA起始部，电凝ECA的分支，游离结扎ECA主干，并在ECA残端置6-0丝线呈一松结。用动脉夹夹闭颈总动脉后，在ECA残端剪0.2mm小口，将栓线插入，结扎ECA处丝线，去除动脉夹。插入栓线深度根据动物的体重决定，平均从CCA分叉处计（18.5±0.5）mm。栓线经ICA分叉处插入颅内至大脑前动脉（ACA），该深度恰好堵塞MCA开口。栓线置于皮肤外并缝合皮肤。再灌流时勿须麻醉，将栓线缓缓由颈外动脉拔出，进行大脑中动脉再灌流。
1.2 实验动物分组
1.2.1 缺血组 8只。该组动物缺血30min，再灌流1.5h后处死。
1.2.2 假手术对照组 8只。手术同前，不夹闭颈总动脉，不插栓线，2h后处死。
1.2.3 缺血加电针组 8只。该组动物缺血30min并缺血即刻电针30min，再灌注1.5h。电针方法:穴位选取按《实验针灸学》，大鼠百会穴在顶骨正中，素穴在鼻端正中。用1寸毫针，沿皮斜刺百会、素二穴，将针柄分别连接至电针仪（上海产G6805）的电极上，接以疏密波，频率5/45Hz，强度以大鼠耳廓轻度颤动为度（约3.0mA），持续30min后处死。
1.3 免疫组化染色（SP法）
1.3.1 主要试剂 C-fos-抗体SP试剂盒，购自福建迈新生物试剂公司广州分公司。
1.3.2 步骤 动物于再灌注1h后断头处死。冰上取脑经10%中性福尔马林固定后，自额极至枕叶分为A、B、C、D、E等份。取B脑片常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片5mm厚。免疫组化染色采用SP法，用已知的阳性片作为阳性对照，用PBS替代抗体作空白对照。具体步骤如下:（1）石蜡组织切片常规脱蜡2次，每次5min。（2）100%、95%、80%梯度酒精水化。（3）0.01MSSC液微波复性，自然冷却，PBS洗3次，每次5min（3×5min，下同）。（4）每张切片加1滴或50μl过氧化物酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min。（5）PBS（pH7.4）冲洗3×5min。（6）每张切片加1滴或50μl的非免疫性动物血清，室温下孵育5min，PBS冲洗一次即可。（7）每张切片加1滴或50μl的第一抗体，室温下孵育60min。（8）PBS（pH7.4）冲洗3×5min。（9）每张切片加1滴或50μl的生物素标记的第二抗体，室温下孵育10min。酶溶液，室温下孵育10min。（10）PBS（pH7.4）冲洗3×5min。（11）每张切片加1滴或50μl的链亲和素—过氧化物酶溶液，室温下孵育10min。（12）PBS（pH7.4）冲洗3×5min。每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5～10min。自来水冲洗，苏木素复苏，中性树胶封固。
1.3.3 结果判断 细胞浆中有棕黄色颗粒者为阳性细胞。每张切片至少记数1000个细胞，平均计算每100个细胞内的阳性细胞数，以百分数表示作为评价标准。
1.3.4 统计学处理 结果以均数±标准差表示（ˉx±s），两组间均数比较用配对样品t检验。
2 结果
各组动物脑组织C-fos表达见表1。假手术组C-fos阳性细胞百分率1.12±0.74;缺血组C-fos阳性细胞百分率为17.15±2.76;电针组C-fos阳性细胞百分率为11.32±1.97;缺血组与假手术组比较差异有非常显著性（P<0.01）;缺血加电针组与假手术组比较差异有非常显著性（P<0.01）;缺血组与缺血加电针组比较差异有显著性（P<0.05）。表明局部脑缺血可诱导脑组织C-fos蛋白的表达，而电针对脑局部缺血后C-fos蛋白表达有明显抑制作用。
表1 各组脑组织C-fos蛋白表达的阳性细胞百分率 （略）
3 讨论
脑卒中是严重威胁人类健康的重大疾病之一，但对其发病机制尚未弄清。近年来，国内外对脑缺血诱导和激活脑内立即早期基因（如C-fos，c-jun）和晚期基因（如神经生长因子、脑源性神经营养因子）等基因表达的研究十分活跃，试图从基因水平阐述脑卒中后继发性神经元损伤的机制，并从基因调控上寻找新的防治方法和措施。
C-fos原癌基因是FBJ和FBR鼠成骨肉瘤病毒（FBJ and FBR murine osteogenic sarcoma virus）所携带的转化基因V-fos的同源系列，并由此而命名。C-fos基因是立即早期基因家族中的一员。正常情况下C-fos mRNA在细胞内的水平很低，但在一系列生理或病理刺激因子作用下其水平可在几分钟内瞬时诱导。近年研究表明，脑缺血可诱导和激活C-fos基因快速、一过性表达。急性脑缺血大脑缺血30min后再灌注10min海马组织即出现C-fos表达增强，60min达高峰，90min以后降至假手术组水平 ［10］ 。目前对C-fos基因在中枢神经元内表达的功能意义还缺乏足够的认识，但C-fos基因表达作为一种标识物，反映了脑内神经元受到缺血损伤后的功能活动状态。脑缺血引起C-fos基因表达的机制可能是由于缺血引起兴奋性氨基酸，特别是谷氨酸的大量释放，激活了磷脂酶C，磷脂酶C的激活引起磷脂酰肌醇（PIP 2 ）降解，生成二酰基甘油（DAG）和三磷酸肌醇IP 3 。IP 3 可以动员细胞内钙库中的钙离子释放到胞浆中，而DAG则可以活化蛋白激酶C（PKC）。钙离子、DAG和IP 3 可能作为第二信使触发了C-fos和IEGs家族的基因表达。C-fos和c-jun相结合形成二聚体可特异性结合到DNA的AP-I结合位点上，使AP-I活性增加，诱发其它基因（迟发性基因）表达增加，发挥其病理生理效应，因此又称C-fos为核内第三信使，如C-fos可引起神经营养因子的表达增加，有助于受损神经元存活和神经网络的修复;引起内皮素基因表达将加重缺血性脑损害 ［11］ ，同时，它还与迟发性神经元死亡和神经元凋亡有关 ［12，13］ 。
本实验结果表明，电针可抑制局脑缺血大鼠C-fos基因表达，提示这可能是电针抗脑缺血的作用信息通路之一 ［14］ 。我们的研究证实，电针对局脑缺血大鼠过量释放的兴奋性氨基酸有明显的抑制作用 ［15］ 。电针是否通过降低脑内兴奋性氨基酸含量而抑制C-fos表达，C-fos又如何对其所调控的靶基因进行选择性转录，有待进一步研究。
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作者单位:1 510632广东广州暨南大学医学院
2 510405广东广州中医药大学针推学院
3 510631广东广州华南师范大学激光运动医学实验室
4 510631广东广州华南师范大学信息光电子科技学院