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Key words tetramethipyazine spinal cord injury c-fos mRNA
即刻早期基因（immediate early genes，IEGs）被认为是急性活动依赖性事件与基因长期表达之间联系的纽带。IEGs中c-fos基因在多种细胞（包括神经细胞）中均有较低水平的表达，并参与细胞的生长、分化、信息传递等生理功能。c-fos是凋亡促进基因，其基因表达与神经元损伤后继发损害有关 ［1～4］ 。川芎嗪（tetramethipyazine，TMP）是近年来研究较多的一种中药单体［1-（5-羟甲基-2-呋喃基）-9H-吡啶并［3，4-b］吲哚］，一种新的钙离子阻断剂 ［4］ ;并已证实TMP能抑制脑外伤后的伤区细胞凋亡 ［5］ 。为了进一步探讨TMP对脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）继发性损害的保护机制，观测了TMP对SCI后c-fos mRNA表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 健康成年封闭群Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠），体重（280±10）g，雌雄不限（由福建省药物研究所提供）;随机分为:生理盐水组（SAL组）30只、川芎嗪治疗组（TMP组）30只。
1.2 动物模型的制备 按改良Allen’s撞击法制作SCI模型。称重后3g/L戊巴比妥钠（按30mg/kg）腹腔麻醉，背部剪毛，将动物俯卧并固定在手术台上，10%活力碘消毒，铺洞巾，以T 8 棘突为中心取背部正中切口，长约2.5cm，显露T 7～9 棘突及椎板。用特制手术钳咬除T 8 棘突及全椎板，以脊髓为中心显露直径约2.8mm圆形区，在硬膜表面垫一弯曲度与脊髓表面一致的塑料垫片，用直径2.4mm、重10g的圆柱状金属棒在细玻璃管的引导下从2.5cm高处垂直落下，打击垫片致T 8 脊髓急性挫伤，致伤力为25gcf（10g×2.5cm），SCI后逐层缝合
切口。术后以恒温电毯保持肛温（37±0.5）℃，精心饲养，不限饮水及进食，人工膀胱排尿3次/d，直至恢复排尿功能。
1.3 给药剂量和方法 TMP组术后即刻给予川芎嗪（200 mg/kg）腹腔注射，SAL组腹腔注射等量生理盐水。
1.4 RT-PCR法测定脊髓组织中c-fos mRNA表达水平
1.4.1 标本收集 按照实验分组，分别于各时间点，将各组中6只大鼠腹腔麻醉后，断头处死，快速暴露损伤区的脊髓，严格无菌操作下取出伤段脊髓组织，冰冻生理盐水冲洗后迅速置于液氮中保存，而后将标本转至-80℃冰箱保存，待提取其总RNA。
1.4.2 细胞总RNA提取 取脊髓组织50mg，根据美国生命技术公司Trizol Totao RNA isolation Reagent说明书提取RNA，细胞总RNA用Rnase Free Dnase-1纯化，紫外分光光度仪估算RNA浓度，琼脂糖凝胶电泳证实RNA无降解。RNA质量符合要求可用于反转录。
1.4.3 半定量RT-PCR 以GAPDH作为内对照，RNA逆转录参照美国生命技术公司SUPERSCRJPR TM Ⅱ逆转录试剂盒说明书进行。CDNA的PCR引物序列和产物长度如下:c-fos-1:5′-ATGATGTTCTCGGGTTTCAA-3′，c-fos-2:5′-TGACATGGTCTTCACCACTC-3′产物长度348bp。
阴性对照为直接用每个样本RNA行PCR，不加引物行PCR，不加cDNA模板行PCR。扩增产物经琼脂糖凝胶电 泳，用凝胶扫描成像分析仪处理系统对c-fos和GAPDH进行光密度扫描定量，用靶基因与内对照的比值表示c-fos mRNA相对表达量。
1.4.4 统计学方法 所有结果均以ˉx±s表示，采用SPSS for window10.0统计程序包，组间差异应用两均数的t检验。以P值表示统计学的差异，P<0.05表示差异有显著性，P<0.01表示差异非常显著性。
2 结果
SAL组c-fos mRNA在SCI后30min、1h、2h、4h、6h均有表达，随时间的推移逐渐升高，2h达到高峰，后逐渐下降;而TMP组c-fos mRNA各时间点的表达水平均明显降低，与SAL组相比，伤后30min差异无显著性（P>0.05），伤后6h差异有显著性（P<0.05），而其余各时相点均差异有非常显著性（P<0.01），见表1，图1、2。
表1 c-fos mRNA在脊髓组织中的表达 （略）
图1 SCI后SAL组c-fosmRNA表达电泳图略
3 讨论
即刻早期基因（immediate early genes，IEGs）在神经科学中的应用始于20世纪80年代后期，该家族有包括c-fos、c-jun在内的近百个成员。C-fos是v-fos的细胞同源物，后者是FBJ和FBR鼠成骨肉瘤病毒所携带的转化基因。正常情况下，大多数细胞中有低水平的c-fos表达。人类的c-fos基因定位于14q21-31，长度为3.5kb，含4个外显子和3个内含子。C-fos mRNA长为2.2kb，它编码的核蛋白（FOS）由380个氨基酸组成，分子量为62kD。人类c-fos基因编码区有90%的序列与小鼠相同，其基因产物FOS蛋白与小鼠FOS蛋白同源性大于94%。以后陆续发现了3种c-fos相关抗原，包括fos-b、fra-1、fra-2，三者与c-fos共同构成c-fos家族，它们的cDNA均已被克隆。
c-fos原癌基因是一种快速、一过性表达的基因，当中枢神经元受到物理、化学等各种刺激后，激活受体和第二信使，诱导c-fos在胞浆中转录合成mRNA，再翻译成原癌基 因蛋白fos，fos蛋白进入胞核中与目的基因结合，激活目的基因的表达而对刺激作出反应。近十年来利用大鼠、小鼠、猫等动物模型研究发现，在癫痫、脑缺血及脑外伤等中枢神经系统受损情况下，c-fos基因在相应的受损区域神经细胞中均出现不同程度的表达增高。C-fos基因属于快速反应基因家族的一员，其表达具有快速、短暂的时间依赖性特征。当机体受到外界刺激作用时，中枢神经系统c-fos基因在数分钟内就有表达增加，解除相应刺激后，其表达也很快消失（表达产物FOS半衰期均2h），不能持续 ［1～4］ 。
SCI后c-fos基因表达的机理尚不十分清楚。目前认为至少有三种第二信使能激活c-fos表达，即甘油二酯依赖的蛋白激酶C（PKC），cAMP和Ca 2+ -钙调蛋白。进一步研究发现，在c-fos5′端上游存在几个调节元件，控制着第二信使和其它信号通路对c-fos表达的诱导，包括cAMP反应元件（CRE）又称钙反应元件（CaRE）;血清反应元件（Serum response element，SRE）;TPA反应元件（TRE）又称AP-1位点，它的核酸序列为-TGACTCA-。研究表明:细胞内的Ca 2+ 增多可诱导c-fos的转录，这一过程也涉及CRE（cAMP response element，CRE），
所以，CRE又称钙反应元件（CRE）。细胞内Ca 2+ 增加，Ca 2+ 与钙调素结合，激活Ca 2+ 钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ），CaMKⅡ进入核内，磷酸化并激活CREB的转录活性，促进CREB与CRE结合，从而诱导c-fos基因的表达。研究显示，在SCI局部，早期（数十分钟）就出现c-fos表达上升，1h即达高峰，12～24h降至正常;在损伤周边区，c-fos表达的出现较损伤区略晚。Yekovlev等在麻醉鼠T 9 节段实施挤压伤（50或100g/cm）后30min，在损伤局部出现与损伤严重性相关的c-fos mRNA的上升，到24h c-fos mRNA在损伤部位已经恢复正常
，但是在T 5 和T 12 则开始上升。刘文革等 ［6］ 用Allen s方法损伤大鼠T 8 脊髓，观察到SCI后损伤区神经元c-fos mRNA表达较正常未损伤神经元显著增加，从损伤后15min开始升高，1h达高峰。另有人利用大鼠脊髓内注射红藻氨酸（kainic acid，KA）造成SCI，结果表明，KA致SCI后2～8h脊髓腹角运动神经元中c-fos mRNA的表达和Fos免疫组织化学阳性反应明显增加，12h恢复至正常水平，伤后3d又明显增强，而脊髓背角神经元内仅在伤后2～6h明显增加。在本实验中，c-fos mRNA在脊髓损伤后30min、1h、2h、4h、6h表达水平均有表达，随时间的推移逐渐升高，2h达到高峰，后逐渐下降。与上述文献报道相吻合。这提示SCI后，c-fos mRNA表达水平明显上调，与脊髓继发性损伤有密切关系，c-fos基因参与了脊髓继发性损伤过程。
关于c-fos在神经损伤中的作用，目前学术界仍存在分歧意见。局部脑缺血时，在缺血中心c-fos表达为弱阳性或阴性，而在缺血周边区c-fos呈强表达;全脑缺血时，对缺血耐受力强的齿状回c-fos表达最快、最明显，而对缺血耐受性差易出现迟发性神经元坏死的海马CAl区，c-fos的表达远远弱于齿状回，甚至出现c-fos mRNA不翻译成FOS的情况 ［1］ 。有学者在大鼠额叶内侧轴索切除术后发现，c-fos基因主要在蓝斑及纹状体区表达;而在神经元变性、坏死最严重的黑质致密层并末发现c-fos表达。从以上资料看，c-fos基因的早期表达对损
伤后神经元修复和生存可能起一定作用。Hayashi ［8］ 等人进一步研究发现在脊髓损伤中即刻早期基因（IEGs），神经营养因子相继表达。C-fos在1h出现最高表达，r-jun在3h为最高表达，到6h则检测不到以上两种基因的表达，6h以后，NGF、脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophicfactor，BDNF）、神经营养因子3（Neurotrophin-3，NT-3）表达开始上升，24～72h达高峰。表明即刻早期基因c-fos、r-jun与神经营养因子的表达有一定关系。目前已有研究证实NGF基因上有AP-1位点，Fos:Jun可能与NGF基因上有AP-1位点结合，促进其表达，从而促进损伤神经元的存活和再生。但与上述相反，Bokesch等人发现右旋甲氧甲基吗啡喃在抑制伤后c- fos表达（mRNA水平降为对照组的（65%～91%）的同时，也明显减弱了伤后海马CAl区神经元的迟发性坏死。Jorˉgensen等 ［9］ 人研究局部脑缺血模型发现，表达c-fos基因的神经元与相邻HE染色切片上见到的坏死神经元的分布极为一致，故认为c-fos基因表达与神经元损伤后继发损害有关。所以，中枢神经系统损伤后c-fos基因表达的作用也可能是双重的。
研究表明，神经细胞在受到刺激与损害后c-fos基因的诱导与谷氨酸受体激活、细胞内Ca 2+ 浓度增加有密切联系。Morgan则认为NMDA促使c-fos mRNA的表达与增强磷脂酰肌醇的降解、PKC激活、钙通道开放有关。细胞内Ca 2+ 增加又可激活CRE进而诱导c-fos基因表达。本实验中，TMP组c-fos基因蛋白的表达低于SAL组（P<0.01），而TMP本身具有阻滞钙内流、清除自由基、改善微循环及减少能量消耗等作用 ［5］ 。因此，我们推测，在脊髓继发性损伤过程中，细胞内Ca 2+ 超载激活c-fos基因的转录和表达，而TMP阻断Ca 2+ 通道，减轻了Ca 2+ 在神经细胞中的蓄积，进而减少c-fos基因蛋白的异常表达。总之，TMP可以下调SCI后c-fos mRNA的表达水平，这可能是TMP对SCI具有保护作用的又一分子机制。
参考文献
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作者单位:1 200003上海第二军医大学附属长征医院骨科
2 350001福建福州福建医科大学附属第一医院骨科
3 230022安徽合肥安徽医科大学第一附属医院骨科