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on acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis-associated lung injury
Liu Hongbin，Cui Naiqiang，Li Donghua，et al.
Tianjin Institute of Acute Abdominal Diseases，Tianjin300100.
【Abstract】 Objective To explore the therapeutic mechanisms of tetramethylpyrazine on acute lung injury inˉduced by acute hemorrhagic necrotizing pancreatitis in rats.Methods One hundred-eight Wistar rats were randomly divided into sham operation group，AHNP group，tetramethylpyrazine group.AHNP model was induced by intraductul administration of5%sodium taurocholate.Tetramethylpyrazine（80mg/kg）was administrated by caudal vein injection30minutes after model induction.Additional animals were used to observe the24hour-mortality.Animals were killed on various hours after model induction（3h，6h，12h）.Pulmonary TNFα，IL-1，IL-6，PLA 2 ，myeloperoxidase（MPO）were examined.NF-κB activation of bronchoalveolar lavage（BAL）macrophages were detected by ELISA method.Amylase，Lipase，PLA 2 of serum and ascites were determined also.Morphologic changes of lung and pancreas were obˉserved under light microscopy.Results Lung injury was markedly reduced in tetramethylpyrazine-treated group and tetramethylpyrazine significantly attenuated NF-κB activation of BAL macrophages.PLA 2 ，TNFα，IL-1，IL-6levels of serum and lung tissue were decreased significantly;24hour-mortality was reduced obviously by tetramˉethylpyrazine.Conclusion Tetramethylpyrazine has significant inhibitory effects on systemic PLA 2 activation in AHˉNP，then can reduce the activation of NF-κB and proinflammatory cytokines production，thus attenuates acute lung inˉjury induced by AHNP.
Key words tetramethylpyrazine pancreatitis-associated lung injury phospholipase A 2 NF-κB cyˉtokines
急性出血坏死性胰腺炎有很高的并发症发生率和病死率，一直是临床重点难题之一。各种并发症中，急性肺损伤受到了越来越广泛的重视。近年来，川芎嗪（tetramˉethylpyrazine，TMP）在呼吸系统疾病治疗中显示出良好作用。本研究旨在观察川芎嗪对实验性急性出血坏死性胰腺炎肺损伤大鼠的治疗作用，并对其作用机理进行探讨。
1 材料与方法
1.1 材料 SPF级Wistar大鼠，由中国药品生物制品检定所动物中心提供;牛磺胆酸钠、卵磷脂为Sigma公司产品;盐酸川芎嗪（TMP）注射液为天津市氨基酸公司人民制药厂产品;RIPA1640培养基、胰蛋白酶为Gibco公司产品;TNFα、IL-1、IL-6ELISA kit为TPI公司产品;TransAM TM NF-κB P 65 chemi ELISA kit购自Active Motif公司;MPO、AMY测定试剂盒购自南京建成生物技术研究所。CO 2 培养箱（美国Forma Scientific）、Centrol LB960型微孔板化学发光检测仪（德国Bethold公司）、Anthos2010型酶标仪。
1.2 方法
1.2.1 大鼠急性出血坏死性胰腺炎模型的建立 参照Aho ［1］ 的方法并加以改进制作大鼠AHNP模型。
1.2.2 实验分组 Wistar大鼠108只，随机分为假手术组（36只）、模型组（36只）、川芎嗪组（36只）。假手术组只开腹翻动腹腔脏器数次即关腹;模型组经胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠（1ml/kg，0.1ml/min）诱发急性出血坏死性胰腺炎;川芎嗪组在造模后30min经尾静脉注射川芎嗪（80mg/kg）。3组动物分别随机分为3h、6h、12h三组（每组8只），其余12只用于观察24h病死率。于3个时间点，麻醉状态下经腹主动脉取血，测定血清淀粉酶、脂肪酶、PLA 2 、TNFα、IL-1、IL-6;抽取腹水，测定淀粉酶、脂肪酶、PLA 2 ;取左肺一部分匀浆，测定MPO、PLA 2 、TNFα、IL-1、IL-6，一部分经10%甲醛固定作病理组织学检查，取右肺进行肺泡灌洗，分离收集并纯化肺泡巨噬细胞，提取核蛋白后采用化学发光ELISA法检测NF-κB（P65）的表达情况;留取胰腺组织进行组织病理学观察。
1.2.3 肺泡巨噬细胞的收集、分离、纯化与核蛋白的提取 ［2，3］ 取右肺行支气管肺泡灌洗，以冷的（4℃）5ml Hanks液经支气管插管入左肺，保留30s后回收，重复3次，将回收的肺泡灌洗液1500rpm4℃离心15min，弃去上清液，以RPMI1640培养液5ml重悬，离心1次，细胞沉淀重悬于RPˉMI1640培养液中（含青霉素100U/ml、链霉素100mg/ml）。取1滴计数，调整细胞浓度，接种于6孔培养板中（1×10 6 /孔），37℃，5%CO 2 条件下培养6h，将未贴壁细胞及培养液弃去，加入含0.25%胰蛋白酶的RPMI1640培养液消化10min，加入胎牛血清终止消化，以RPMI1640培养液洗涤细胞2次，细胞沉淀先后加入细胞裂解液A（10mmol/L HEPˉES，pH7.9;10mmol/LKCl;0.1mmol/L EDTA;0.1mmol/EGTA;1mmol/L DTT;1mmol/L PMSF）、缓冲液C（20mmol/L HEPES，pH7.9;0.4mol/L NaCl;1mmol/L EDTA;1mmol/L EGTA;1mmol/L DTT;1mmol/L PMSF），提取核蛋白，Bradford法蛋白定量后，-80℃保存，备测NF-κB。
1.2.4 检测指标 （1）血清AMY测定:采用碘比色法，结果以U/L苏氏单位表示;（2）血清、腹水及肺组织中PLA 2 的测定:采用陈思锋的酸滴定法 ［4］ ;（3）血清TNFα、IL-1、IL- 6测定:采用ELISA法，酶标仪检测;（4）肺组织MPO测定:采用MPO试剂盒按说明书进行;（5）肺组织及肺泡巨噬细胞中NF-κB活性测定:采用TransAM TM NF-κB P 65 Chemi ELISA试剂盒检测NF-κB活性。这种试剂盒采用化学发光标记，灵敏度为常规EMSA方法的140倍。具体方法:准确吸取各组巨噬细胞核蛋白提取物1.25μg，用细胞裂解液稀释到20μl，加入到包被有NF-κB特异寡核苷酸双链探针的样品孔中，设阳性对照（1.25μg Hela细胞蛋白提取物，稀释于20μl细胞裂解液）及空白对照（只含细胞裂解液），于室温振荡1h（100rpm），洗板3次，加稀释的NF-κB P 65 一抗（1:1000），室温反应1h（勿振荡），再次洗板3次，加入1:10000稀释的二抗，室温反应1h，洗板4次，用吸水纸吸干水分后，加入化学发光工作液，反应10min后，经微孔板化学发光检测仪检测RLU（relative light units）值。实验中设置竞争对照孔以示检测的特异性，其余操作同前;（6）肺、胰腺病理组织学检查:10%中性甲醛固定，常规HE染色，光镜下观察，肺脏病理评分按文献标准 ［5］ 进行。
1.3 统计学方法 实验数据采用SPSS11.0统计软件进行分析。
2 结果
2.1 24h病死率观察 SHAM组术后24h内无死亡，病死率为0;AHNP组术后24h内有7只死亡（7/12），病死率为58.3%;川芎嗪组术后24h内有2只死亡（2/12），病死率为16.7%，与AHNP组比差异有显著性（P<0.05）。
2.2 血清酶学检测结果 AHNP大鼠在不同时间段血清Amylase，Lipase及PLA 2 水平均显著升高;而应用川芎嗪可显著降低三种酶的血清水平，见Table1。
2.3 血清TNFα、IL-1、IL-6测定结果 AHNP大鼠在不同时间段血清TNFα、IL-1、IL-6水平均显著升高;而川芎嗪显著降低了三种细胞因子的血清水平，见Table2。
Table1 Serum Amylase，Lipase and PLA 2 levels in all groups （略）
Table2 Serum TNFα、IL-1、IL-6levels in all groups （略）
2.4 腹水中Amylase、Lipase、PLA 2 水平 AHNP大鼠在造模术后不同时间腹水Amylase、Lipase、PLA 2 水平均显著升高;腹水生成量亦显著增多;而川芎嗪可显著降低腹水中三种酶水平，且能明显减少腹水生成量，见Table3。
2.5 肺组织MPO、PLA 2 、TNFα、IL-1、IL-6测定结果 AHˉNP大鼠在不同时间肺组织中MPO、PLA 2 、TNFα、IL-1、IL-6 水平均显著升高;而应用川芎嗪可显著降低其水平，见 Table4。
2.6 肺泡灌洗液巨噬细胞NF-κB活性 AHNP造模后3h、6h、12h BALF巨噬细胞中NF-κB活性显著升高，明显高于SHAM组（P均<0.01）;川芎嗪组造模后3h、6h、12h巨噬细胞中NF-κB活性受到显著抑制，与AHNP组比差异有显著性（P均<0.05），见Table5。
Table3 Ascitic volume，Amylase，Lipase and PLA 2 levels in all groups （略）
2.7 胰腺病理组织学检查
2.7.1 大体观察 AHNP造模3h后胰腺明显出血、坏死，有血性腹水出现;6h及12h后胰腺呈大片坏死，大量血性腹水，胰腺及胰周组织出现皂化斑。川芎嗪组胰腺出血程度减轻，血性腹水生成量明显减少;SHAM组胰腺无明显异常。
2.7.2 光镜观察 AHNP组3h胰腺可见明显出血、坏死灶，大量炎性细胞浸润;6h胰腺病变主要以坏死为主要表现，坏死较为彻底;12h胰腺彻底坏死，胰小叶结构消失。 川芎嗪组胰小叶坏死轻微，小叶结构完整，病变以腺泡细胞变性、白细胞浸润、间质水肿为主。SHAM组胰腺无明显异常。
2.8 肺组织学检查
2.8.1 大体观察 AHNP组3h、6h、12h肺组织体积增大，重量增加，呈暗红色，包膜下可见出血灶，切面有血性液体渗出;川芎嗪组造模后3h、6h、12h肺脏体积未见增大，包膜下未见明显出血，切面无明显血性渗液渗出;SHAM组大鼠肺外观色泽粉红，无明显异常。
2.8.2 光镜检查 AHNP组3h、6h、12h肺组织病变以广泛肺泡出血、肺间隔增厚、肺间质淤血、大量炎性细胞浸润为主，组织学评分显著高于SHAM组（P值均<0.01）;川芎嗪组造模后肺组织肺泡出血轻微，肺间质无明显淤血，炎性细 胞浸润显著减轻，组织学评分显著低于AHNP组（P值均<0.05）。SHAM组肺组织基本正常（肺组织学评分见Table6）。
Table4 Lung tissue MPO，PLA 2 ，TNFα，IL-1，IL-6levels in all groups （略）
Table5 NF-κB activation of macrophages in BALF（RLU） （略）
3 讨论
川芎嗪（TMP）是从伞形斜藁本科植物川芎总生物碱中分离得到的一种有效活性生物碱，其化学结构为1-（5-羟甲基-2-呋喃基）-9H-吡啶并［3，4-b］吲哚。研究证明其具有行气活血与活血化瘀之功效 ［6，7］ 。例如有研究发现川芎嗪可以下调大鼠肝/肾缺血再灌注损伤引起的P-选择素的表达，从而减轻中性粒细胞的浸润，使肝肾功能得到明显改善，肝肾病理学改变也显著减轻 ［8］ 。
由于其具有很强的扩张血管、缓解痉挛，改善微循环，降低血粘度，改善血流变，增加肺脏微循环血流量的作用， 近些年来亦将其应用于急性肺水肿及油酸性ARDS的防治，并取得了令人满意的效果 ［9～14］ 。本实验应用川芎嗪对急性出血坏死性胰腺炎肺损伤大鼠进行治疗。实验结果显示，大鼠病死率下降，肺组织MPO水
平降低，肺组织病理形态学改善。还观察到动物血中、肺组织中、腹水中PLA 2 活性下降，肺泡灌洗液中巨噬细胞的NF-κB活性下降，血中、肺组织中TNFα、IL-1、IL-6水平下降，因而认为川芎嗪对急性出血坏死性胰腺炎肺损伤有确切的疗效。
川芎嗪治疗AHNP-ALI的机制目前尚无定论。有研究认为AHNP-ALI时存在着明显的TXA 2 -PGI 2 平衡失调，其后果是导致肺血管痉挛、肺动脉高压、肺血管通透性及气道阻力增高。而川芎嗪能够抑制TXA 2 合成并能对抗TXA 2 样物质的活性，促进动脉壁PGI 2 合成，因而认为具有调节TXA 2 -PGI 2 平衡的作用 ［15］ 。另外还证实川芎嗪可以减轻氧自由基及其代谢产物LPO对肺脏的损伤，减少人外周血多形核细胞NO的分泌。
有研究报道川芎嗪可抑制由金葡菌毒素诱生的人外周血单核细胞IL-1β、TNFα的分泌，降低IL-1β、TNFα的mRˉNA的表达。本研究显示川芎嗪可以使AHNP大鼠循环血、肺组织中的TNFα、IL-1、IL-6水平显著降低，同时支气管肺泡灌洗液巨噬细胞NF-κB表达亦显著降低，提示NF-κB表达与TNFα等细胞因子的生成有密切关系。
本研究中川芎嗪治疗组，血、肺、腹水中PLA 2 活性下降，可能与川芎嗪的Ca 2+ 通道拮抗作用有关。通过拮抗Ca 2+ ，使得PLA 2 活性下降，减少PLA 2 引发的一系列损伤作用，抑制NF-κB活性，下调细胞因子的表达，减轻对肺组织的损伤。
本研究还发现川芎嗪对胰腺病变也有保护作用，推测与其改善胰腺微循环有关。另外，有研究显示川芎嗪可以促进胰液及胆汁的排出，是否与其对胰腺的保护作用有关值得进一步研究。
综上所述，我们认为川芎嗪通过多种作用途径对AHˉNP-ALI起到了治疗作用:（1）缓解高凝状态，降低血黏度，改善肺组织微循环;（2）发挥Ca 2+ 拮抗作用，阻断Ca 2+ 内流，直接发挥扩张血管及支气管作用;（3）抑制磷脂酶A 2 活性，降低NF-κB表达，下调多种细胞因子的产生，减轻对肺组织的损伤;（4）清除氧自由基，减少NO、TXA 2 、内皮素等血管活性物质的产生。
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基金项目:天津市自然科学基金资助课题（编号:013612511）
作者单位:300100天津市中西医结合急腹症研究所