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关键词 子宫内膜异位症 抑癌基因 PTEN 孕三烯酮 凋亡
PTEN gene is involved in gestrinone induced apoptosis of ectopic endometrium cells
Ma Jiajia，Chen Biliang，Ma Xiangdong，et al.
Department of Gynecology and Obstetrics，Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University，Xi’an710033.
【Abstract】 Objective To find out the effects of gestrinone on the expression of PTEN gene and to investigate the underlying mechanism of inhibition and apoptotic action that caused by gestrinone on isolated ectopic endometrium cells in vitro.Methods Ectopic endometrium cells were cultured in vitro.After being cultured with different dose of gestrinone for different time，the cells were examined by MTT assay，transmission electronic microscope，flow cytometry and nucleus DNA agarose gel electrophoresis to detect the apoptotic changes in them.The changes of PTEN gene exˉpression were detected by western-blot analysis.Results Gestrinone at different concentrations can inhibit the growth and proliferation of ectopic endometrium cells in a dose-and time-dependent manner.The typical changes of ultrastructure included peripheral accumulation of nuclear chromation，fragmentation of nuclear and apoptosis body.Cell cycle determined by flow cytometry showed that the percentage of G 1 phase increased，but the percentage of S phase decreased;one visible apoptosis peak（15.0%）in front of the G 1 phase was also found.The characteristic DNA ladder was found in the agarose gel electrophoresis of the nuclear DNA of the cells.Expression of PTEN gene was eviˉdently up-regulated in these cells（P<0.05）.The untreated cells had no abnormal performance，and the PTEN gene expression was at a low level.Conclusion Gestrinone can cause the apoptotic effect of the ectopoc endometrium cells and up-regulate the PTEN gene expression.This function may result in the treatment effect of gestrinone on enˉdometriosis. Key words endometriosis tumor suppressor gene PTEN gestrinone apoptosis
19世纪80年代后，孕三烯酮已被广泛应用于子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）的治疗，但迄今为止，有关其确切作用机制的研究报道较少。新近发现的第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（phosphatase and tenˉsion homologue deleted on chromosome10，PTEN）能对细胞生长、凋亡、增殖及粘附等多个方面产生影响，并已被认为是子宫内膜的看家基因，在多种子宫内膜病变的发生发展中发挥着重要作用 ［1］ 。本实验运用多种检测手段，观察孕三烯酮对体外培养的异位子宫内膜细胞生长增殖和凋亡的影响以及抑癌基因PTEN在这一过程中的作用，探讨孕三烯酮治疗EMs的分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象 选取2004年1月～2004年4月在西京医院妇产科行剖腹手术的EMs患者13例，平均年龄（35±1.2）岁，所有患者无内科合并症，术前3个月内无激素用药史，术中取患者典型的异位病灶（包括卵巢巧克力囊肿的囊壁及腹壁异位灶）标本进行原代子宫内膜异位症细胞培养。标本留取部分组织经10%甲醛固定，送病理学检查明确诊断。
1.1.2 主要药品及仪器 胎牛血清，杭州四季青公司产品;DMEM培养基，美国Gibco公司产品;PTEN单克隆抗体，福州迈新公司产品;孕三烯酮，北京第三制药厂产品，用时以细胞培养液稀释至所需浓度;Hybone-C膜，英国Amerˉsham公司产品;MTT、EB、PI、二甲基亚砜（DMSO），美国sigma公司产品。透射电子显微镜，倒置显微镜，日本Olympas公司产品。
1.2 方法
1.2.1 组织处理及细胞分离、纯化 参照文献 ［2］ 的方法对EMs患者的异位子宫内膜细胞进行原代培养。细胞接种24h后换液，弃去未贴壁细胞。继续培养，间隔2～3d换液。倒置显微镜下观察原代培养细胞的形态及生长情况。
1.2.2 细胞生长抑制实验 采用四甲基偶氮唑兰（MTT）比色法。将进入对数生长期的子宫内膜异位症细胞以1×10 4 个/ml的浓度接种于96孔培养板，37℃、5%CO 2 培养箱中培养24h，经同步化处理后，在培养体系中加入孕三烯酮，使其终浓度分别为0、10 -3 、10 -4 、10 -5 和10 -6 mol/L，每组设12个平行孔，继续培养24h和48h。检测前4h每孔加入2μl MTT（5g/L），37℃温箱中孵育4h后吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，振荡10min，酶联检测仪测定A 490 值。空白对照孔调零，只加培养液不加细胞。按公式计算细胞生长抑制剂:（1-加药组A 490 值）/对照组A 490 值×100%，实验重复3次，取平均值，使用Microsoft Excel软件绘图。
1.2.3 透射电镜观察细胞形态学变化 待细胞长至对数生长期后，分别以含有0、10 -6 和10 -4 mol/L孕三烯酮的培养液培养细胞24h，弃去培养液，常规胰酶消化，收集细胞，0.01mol/L PBS洗涤3次，2.5%戊二醛固定和1%锇酸双固定，常规方法包埋，超薄切片，铀-铅双染色，在透射电镜下观察凋亡细胞的超微结构改变并摄片。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率 分别用0、10 -6 和10 -4 mol/L孕三烯酮作用于细胞，24h后收集各组细胞制成单细胞悬液，细胞样品分为2份，1份800r/min离心15min，弃去上清液，PI染色后，用流式细胞仪检测凋亡细胞的百分率。另1份样品以75%无水乙醇4℃固定4h以上;送检前以PBS洗涤2次，调整细胞浓度为1×10 6 个/ml，PI染液染色，流式细胞仪检测细胞周期分布情况，观察G 1 期、G 2 期、S期细胞所占百分比。
1.2.5 免疫印记（Western-blot）检测子宫内膜异位症细胞中PTEN基因的表达 在子宫内膜异位症细胞培养体系中加入孕三烯酮，使其终浓度为10 -4 mol/L，继续培养0、12h、24h、36h和48h，收集细胞，参照文献 ［3］ 提取细胞总蛋白。取20μg蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，再用电转移到Hybone-C膜上;50g/L脱脂奶封闭2h后，加入PTEN单克隆抗体（1:100），4℃孵育过夜;TBS液洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗常温孵育2h，TBS再次漂洗，最后用DAB显色系统显色。Western-blot结果经Uvp grab-it Image1软件采集，Gelworks1D Advanced V4.01软件处理分析，计算条带的积分相对密度值，以β-actin的水平作为等量蛋白质上样对照，采用目的条带与β -actin的相对密度值的比值来表示待测样本的含量。
1.2.6 凋亡细胞的基因组DNA电泳 细胞经不同浓度的孕三烯酮处理后，加入2ml裂解缓冲液（50mmol/L Tris-HCL pH8.0，20mmol/L EDTA，pH8.0，20g/L SDS），37℃过夜，然后加入0.8ml饱和NaCl溶液，3000r/min离心60min，2次。合并上清液，加入终浓度20mg/L RNA酶，37℃孵育15min，经2倍体积无水乙醇沉淀DNA，取15μl核DNA上样，在12.5g/L琼脂糖凝胶上电泳过夜，EB染色后紫外灯下观察。DL-2000用作分子量标志。
1.3 统计学方法 用SPSS11.5软件进行χ 2 检验、单因素方差分析和t检验，所有数据均以ˉx±s表示，P<0.05认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 子宫内膜异位症细胞的原代培养 成功分离培养EMs患者子宫内膜10例，成功率为76.9%（10/13）。经胶原酶消化后细胞数多的标本培养成功率高;巧克力囊肿标本较腹壁异位标本更易培养，特别是巧克力囊肿内壁有新鲜出血者，细胞容易贴壁生长。倒置显微镜下观察培养24h后的原代子宫内膜异位症细胞见腺上皮细胞呈星形或多角形，旋涡状成团生长，核圆而大;间质细胞呈纺锤形，中间稍宽，两头尖，伸展挺直状平铺状生长，细胞排列无极性，核圆居中（图1A，B）。
2.2 孕三烯酮对子宫内膜异位症细胞的生长抑制作用 孕三烯酮对子宫内膜异位症细胞具有显著的生长抑制作用，浓度值高，作用时间越长，抑制作用越强;对照组（0mol/L）细胞接种后生长迅速（图2）。
2.3 细胞发生凋亡的形态学变化 透射电子显微镜下可见加药组细胞发生典型的凋亡形态学改变。子宫内膜异位症细胞核染色质浓缩、边集于核膜，呈境界清楚的块状或半月状;细胞核碎裂，核膜完整，胞浆浓缩;胞质内细胞器较完整，未见破坏;细胞膜表面微绒毛消失，出现典型的凋亡小体（图3）。
2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期 细胞周期检测发现，给药组细胞G 1 期细胞数量增加，S期细胞数减少，细胞周期阻滞于G 1 期;10 -4 mol/L组细胞在G 1 峰左侧出现亚二倍体峰，占细胞总数的15.0%。未经孕三烯酮处理的子宫内膜异位症细胞生长良好，细胞周期正常（图4，表1）。子宫内膜异位症细胞经孕三烯酮作用48h后，与对照组相比，凋亡区域细胞发生凋亡的数量明显升高，细胞损伤加重，细胞凋亡率显著升高（P<0.05），见图5，表2。
2.5 PTEN蛋白的表达 流式细胞仪分析结果显示:Westˉern-blot检测结果显示，孕三烯酮作用12h后，出现一条相对分子质量为60kD的条带（图6），随作用时间的延长，PTEN蛋白的表达量明显增高，相对密度值分别为（110.31±12.11）、（1973.29±80.49）、（2137.51±65.00）、（3583.57±124.09）和（6673.86±274.49），各时相间差异有显著性（P<0.05），（图7）。
2.6 细胞核电泳分析 可见10 -4 mol/L组子宫内膜异位症细胞核DNA裂解为180～200bp及其整数倍的寡核苷酸片段，形成典型的阶梯状电泳图谱（DNA ladder）。10 -6 mol/L组及未加药组子宫内膜异位症细胞的细胞核DNA仅在加样孔附近出现基因组条带，无DNA ladder形成（图8）。表1 流式细胞仪显示3组异位子宫内膜细胞周期变化 （略）
3 讨论
子宫内膜异位症是一种具有侵袭性的妇科常见病，近年国内报告的临床发病率约为10%。目前，EMs的治疗目的是以缓解疼痛，去除异位内膜病灶和恢复患者正常的解剖及生理功能为主。临床上除采用常规的经腹手术和腹腔镜手术外，已越来越多的采用药物在术前或术后进行保守治疗，以缓解患者症状和预防复发。EMs属于良性病变，异位的子宫内膜也极少发生恶变，但其浸润、种植、远处转移，与周围组织严重粘连，对其他组织或器官侵袭或破坏的生物学行为却与恶性疾病极其相似。有学者认为，子宫内膜异位症细胞得以在盆腔内种植及存活，与其抗凋亡性增强，具有较强的粘附性，能够侵袭性生长和具有肿瘤样增殖特性的特点有关 ［4］ 。因此，寻找一种有效的手段诱导异位子宫内膜细胞凋亡，促使其自然消退，将成为一种治愈EMs的可行方法。
PTEN基因是与细胞生长、凋亡、增殖及粘附等多种细胞生物学行为相关的抑癌基因。该基因是第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于人常染色体10q23.3，具有9个外显子，其序列内含有1212个核苷酸组成的开放阅读框，编码403个氨基酸组成的蛋白质 ［5］ 。目前有关PTEN基因抑制细胞增殖的机理尚不清楚，但有研究认为抑癌基因PTEN可能是一种促凋亡因子，过表达的PTEN能增加凋亡细胞的数量，甚至在细胞周期G 1 期阻滞开始后，亦可增加细胞对凋亡刺激的敏感性 ［6］ 。特别是PTEN所特有的脂质磷脂酶活性可以使细胞由G 0 /G 1 期到S期转变停滞，诱使细胞停滞于G 1 期并促进细胞凋亡 ［6］ 。本实验发现，孕三烯酮作用后子宫内膜异位症细胞抑癌基因PTEN的表达水平明显上升，细胞周期发生相应改变，子宫内膜异位症细胞发生G 1 期阻滞，G 0 /G 1 期细胞增加，S期细胞减少，凋亡细胞的数量显著增多，说明孕三烯酮对子宫内膜异位症细胞的抑制效应可能由凋亡引起，这种效应与表达上调的抑癌基 因PTEN所引起的细胞周期调控机制的改变和细胞对凋亡 敏感性的增强有关。
孕三烯酮是一种人工合成的睾酮衍生物，具有较强的抗雌激素、孕激素及中度抗促性腺激素的作用，是目前临床治疗EMs的主要药物之一。临床实验表明，孕三烯酮能够直接作用于异位病灶，使之萎缩退化，显著降低患者AFS评分，明显缓解病人痛经等症状 ［7］ 。目前已有学者认为孕三烯酮能够通过诱导异位子宫内膜细胞的凋亡发挥效应，但其确切的作用机制仍有待进一步探讨。实验中发现，孕三烯酮明显抑制了异位子宫内膜细胞的增殖活性，这种效应与孕三烯酮的作用浓度和处理时间密切相关。此外，孕三烯酮处理后的异位子宫内膜细胞不仅出现了亚二倍体，还发生了典型的凋亡形态学变化，提示:抑制异位子宫内膜细胞的生长增殖并诱导其凋亡是孕三烯酮起效的主要机制之一。综上所述，孕三烯酮能够诱导子宫内膜异位症细胞的凋亡并上调PTEN基因的表达，这可能是孕三烯酮治疗子宫内膜异位症的分子机制之一。但这种作用是否仅受PTEN基因单一因素的影响，有待进一步研究。（本文图片见附页2）
参考文献
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作者单位:710033陕西西安第四军医大学西京医院妇产科