单抗板淋巴细胞毒法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27

     【摘要】 目的 探讨单抗板淋巴细胞毒法检测强直性脊柱炎患者HLA-B27临床应用的可行性。方法 用单抗板淋巴细胞毒法（免疫磁珠法分离淋巴细胞）检测145例AS患者及56例AS疑诊患者的HLA-B27表达。同时以201份样本PCR-SSP检测结果作对照。结果 与PCR-SSP法比较，单抗板淋巴细胞毒法的灵敏度为96.3%，特异度为86.8%，误诊率为13.2%，漏诊率为3.7%，阳性预告值为94.9%，阴性预告值为90.2%，总符合率为93.7%。单抗板淋巴细胞毒法重复性好。结论 单抗板淋巴细胞毒法具有准确、实用、快速、易于掌握和开展等优点，适合于基层医院临床应用。

    　关键词 单克隆抗体 微量细胞毒法 强直性脊柱炎 HLA-B27

    　Detection of HLA-B27by microcytotoxic assay with monoclonal  antibody plate in patients with ankylosing spondylitis 

   　 Pan Jingfang，Huang Ying

    　Medical Branch College，Hubei Profession&Technology College，Xiaogan432100.
 
    　【Abstract】 Objective To investigate the clinical possibility of detection of HLA-B27by microcytotoxic asˉsay with monoclonal antibody plate in patients with ankylosing spondylitis（AS）.Methods The expression of HLA-B27in145AS patients and56patients related disorders was detected by microlymphocytotoxic assay with monoclonal antibody plate.And then the detective results of HLA-B27by PCR-SSP in the same samples as controls.Results The sensitivity，specificity，rate of false-positive and rate of false-negative were96.3%，86.8%，13.2%and3.7%，respectively.The total rate of accordance was93.7%.The method had excellent replication.Conclusion Detecˉtion of HLA-B27by microcytotoxic assay with monoclonal antibody plate has proved to be a high-sensitivity，high specificity，rapid and convenient technique，suitable for clinical application. Key words monoclonal antibody microlymphocytotoxic assay ankylosing spondylitis HLA-B27

    　B27是HLA-B位点上一个重要的等位基因，它与强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）密切相关 ［1，2］  ，HLA-B27检测已成为临床诊断AS的重要辅助手段。因此，提高实验的精确度、防止漏诊和假阳性是实验室为临床提供实验依据的关键。传统的NIH微量细胞毒法由于细胞纯度不高、多价抗血清特异性较差等缺点，已逐渐被PCR-SSP技术取代 ［3］  ;但PCR-SSP技术实验过程较为繁琐、实验条件要求较高不适用于基层医院。随着B27单克隆抗体及免疫磁珠的商品化，极大地提高了淋巴细胞毒法的特异性，弥补了传统血清学方法的不足。我们分别用单抗板淋巴细胞毒法（免疫磁珠法分离淋巴细胞）检测145例AS患者及56例AS疑诊患者的HLA-B27表达，探讨单抗板淋巴细胞毒法临床应用的可行性。

    　1 　资料与方法

    　1.1 研究对象 145例AS确诊患者，56例AS疑诊患者，共201份血标本全部来源于2001年10月～2003年10月湖北孝感市惠济医院和应城市人民医院住院及门诊患者。AS诊断采用1984年改良纽约标准 ［4］  。

    　1.2 单抗板淋巴细胞毒法   

   　 1.2.1 免疫磁珠法分离T淋巴细胞 取患者静脉血2ml，肝素抗凝，加入全血CD3免疫磁珠（Miltenyi，德国）20μl，混   匀后室温下放置5min，应用自动磁性细胞分选仪（auˉtoMACS）（Miltenyi，德国）收集的阳性选择细胞即为T淋巴细胞。

    　1.2.2 单抗板反应 取B27单抗板（Serotec，美国）1块，5孔分别为阴性对照孔、阳性对照孔、两个单抗孔和1个多抗孔，每孔加入1μl蒸馏水溶解，然后在每孔中分别加入1μl细胞提取液、1μl补体（Serotec，美国）、5μl石蜡油覆盖，室温下反应1h。在每孔中加入5μl终止液（Serotec，美国）。

    　1.2.3 结果观察及判定 荧光倒置显微镜（Nikon，日本）下观察结果，死亡细胞呈红色荧光，活细胞呈绿色荧光，死亡细胞比例0～20%记为2分，30%～40%为4分，60%～80%为6分，80%～100%为8分。结果判定如下:阴性对照孔为2分，阳性对照孔为8分，符合此条件者为有效结果;两个单抗孔和1个多抗孔至少有2孔为6分或8分者判为阳性，若3孔均4分或4分以下者判为阴性，若1孔为6分或8分，余孔为4分则判为可疑。

    　2　 结果

　　201份标本中，经单抗板淋巴细胞毒法检测138份B27（+），12份结果可疑，51份B27（-）。可疑标本经PCR-SSP检测后8份B27（+），4份B27（-）。 同时将201份样本以PCR-SSP检测，155份为B27（+），46份为B27（-）。与PCR-SSP法比较，单抗板淋巴细胞毒法的灵敏度为96.3%，特异度为86.8%，误诊率为13.2%，漏诊率为3.7%，阳性预告值为94.9%，阴性预告值为90.2%，总符合率为93.7%。    重复性实验:HLA-B27阳性和阴性的样本各5份，采用单抗板淋巴细胞毒法重复实验5次，均获得相同的结果。

   　 3　 讨论

    　HLA-B27是与AS相关性最强的HLA分子，对AS的早期诊断与判断预后意义重大 ［1，2］  。传统的血清学方法因难以获得高质量单价抗血清、单份血清易呈假阴性或假阳性及多份血清出现部分血清阳性时难以判断结果等缺点，使其可靠性下降。随着分子生物学技术的发展，PCR-SSP技术已逐渐取代传统的血清学方法而成为检测HLA-B27的常用方法 ［3］  。但PCR-SSP检测的是HLA-B27的基因型，而血清学技术检测的是HLA-B27的表型，两者所反映的情况并不完全一致，携带B27基因的细胞表面并不一定有B27抗原表达。因此，检测B27抗原的表达即其表型，可能对临床诊断更有意义。随着免疫磁珠分选技术及抗体制备技术的发展，现能制备分选高纯度T淋巴细胞的免疫磁珠 ［5］  及高效价HLA-B27单抗。能获取高纯度的T淋巴细胞及HLA-B27单抗的特异性等弥补了多价抗血清法的不足，大大提高了检测结果的准确性。我们使用的单抗板设计了两个单抗孔和1个多抗孔来判断结果，根据3个孔的评分情况可得出3类结果:阳性、可疑和阴性。单抗板淋巴细胞毒法与PCR-SSP法的检测结果比较，其灵敏度为96.3%，特异度为86.8%，误诊率为13.2%，漏诊率为3.7%，总符合率为93.7%。可疑标本12份，占5.9%，经PCR-SSP检测后8份（+），4份（-）。单抗板淋巴细胞毒    法可疑标本经PCR-SSP检测为阳性可能与某些AS患者 细胞表面HLA-B27表达较低有关;可疑标本经PCR-SSP检测为阴性可能与少数患者细胞表面抗原与B27单抗之间的交叉反应有关。与PCR-SSP技术相比，单抗板淋巴细胞毒法更为简便快捷（一般在3h内即可完成，而PCR-SSP法常需过夜），操作过程简单，易于掌握，实验人员的工作量大大降低;除自动磁性细胞分选仪及荧光显微镜外不需其他特殊仪器，因此在基层医院易于开展。其缺点是标本不能长期存放以及有小部分可疑结果，对于可疑标本应慎重处理，可加做PCR-SSP以确定其基因型，此种情况毕竟为少数。总之，单抗板淋巴细胞毒法具有准确、实用、快速、易于掌握和开展等优点，适合于基层医院临床应用。

    　参考文献

     　1　 Liu Y，Li J，Chen B，et al.Familial aggregation ankylosing spondylitis in southern China.J Rheumatol，2001，28（3）:550-554.

    　2　 Olerup O.HLA-B27typing by a group-specific PCR amplification.Tissue Antigens，1994，43（4）:253-256.

    　3　 王庆华，谭进明.采用PCR-SSP法检测HLA-B27基因.中国免疫学杂志，2000，16（3）:149-150.

    　4　 Van de Linden SJ，Valkenburg HA，Cats A.Evaluation of diagnostic criˉteria for ankylosing spondylitis:a proposal for modification of the New York Criteria.Arthritis Rheum，1984，27:361-368.

    　5　 Stanciu LA，Shute J，Holgate ST，et al.Production of IL-8and IL-4by positively and negatively selected CD4 + and CD8 + human T cells following a four-step cell separation method including magnetic cell sorting（MACS）.Immunol Methods，1996，189:107-115.

    　作者单位:432100湖北孝感湖北职业技术学院医学分院 

    　湖北省应城市人民医院检验科