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The Teaching and Reasearch Office of Microbioloimmunology，Medical College of Inner Mongolia，Neimenggu010059.
【Abstract】 Objective To explore the effects of survivin antisense RNA on apoptosis in pancreatic cancer cell line PANC-1.Methods A survivin antisense eukaryotic vector pcDNA3-SVVas prepared in previous study was delivered into PANC-1mediated by electroperforation.Cell survival fraction was determined using the trypan blue dye exclusion assay.Apoptosis was detected by nuclear staining.Results We obtained two positive cell clone PANC-1/SVVas and PANC-1neo by eletroporation.Compared to PANC-1and PANC-1/neo cells，PANC-1/SVVas cells growth was significantly reduced（P<0.05）.Nuclear become condense in PANC-1/SVVas cells.Conclusion Surˉvivin antisense RNA could induce apoptosis in pancreatic cancer cell line PANC-1.This may lay an experimental foundation for further research of gene therapy in pancreatic cancer.
Key words survivin pancreatic cancer antisense RNA
反义技术下调survivin基因的表达，可明显抑制肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤细胞对各种化疗药物的敏感性，并诱导肿瘤细胞凋亡 ［1，2］ 。
本研究将已构建的survivin反义核酸真核表达载体通过电穿孔技术转入PANC-1细胞中，探讨survivin反义核酸诱导PANC-1细胞的凋亡作用，期望为临床胰腺癌的治疗开辟一条新途径。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器 survivin反义核酸真核表达载体pcDNA3-SVVas由本室构建，人胰腺癌细胞株PANC-1由本室保存。Taq DNA聚合酶，逆转录试剂盒（MBI），RPMI1640，TRIzol RNA分离试剂（GIBCO）。细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒（Beytime Biotechnology）。电穿孔仪（Gene Pulser）（Eppendorf产品），荧光显微镜。
1.2 电转染PANC-1细胞及阳性克隆的筛选 收集1×10 6 细胞于预冷的0.2cm电转杯中，加入所构建的反义核酸表达质粒pcDNA3-SVVas5μg，终体积≤400μl，采用300V电压脉冲15ms，电穿孔48h后20:1传代，更换含G418800μg/ ml的培养基筛选，每3～5d传代一次，15d后可见抗性细胞生长，改用含G418200μg/ml的培养基维持培养2w，观察细胞生长情况。同时转染pcDNA3空载体对照，筛选到的阳性克隆分别命名为PANC-1/SVVas和PANC-1/neo。
1.3 转染细胞survivin mRNA表达的检测 PANC-1、PANC-1/SVVas和PANC-1/neo细胞培养48h后，收集1×10 6 个细胞，提取总RNA逆转录成cDNA，进行PCR反应检测survivin mRNA的表达。引物序列为，上游引物:5′-CATGGGTGCCCCGACGTT-3′，下游引物:5′-TCAATCCATGˉGCAGCCAGCT-3′，并以β-actin为内参照。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照。
1.4 细胞生长曲线 每瓶接种1×10 4 细胞，每种细胞接种3个复瓶，台盼蓝染色后，记数活细胞，每瓶记数3次，连续测定5d，绘制生长曲线。
1.5 细胞凋亡-Hoechst核染色 离心收集细胞于1.5ml离心管内，采用细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒（Beytime Biotechnology）按照说明书操作对各组细胞进行检测。
1.6 统计学方法 显著性检验用t检验。
2 结果
2.1 反义核酸对PANC-1细胞survivin mRNA表达的影响 分别提取PANC-1、PANC-1/SVVas和PANC-1/neo细胞的RNA，逆转录成cDNA后进行PCR。RT-PCR产物电泳结果如图1所示，转染pcDNA3-SVVas后，PANC-1细胞的PCR产物电泳带较对照组明显减弱，而不影响β-actin的表达，说明我们所构建的survivin反义RNA真核表达载体的抑制作用具有特异性，同时也提示转染成功。
2.2 反义核酸对PANC-1细胞增殖的影响 图2可见，PANC-1/neo细胞的增殖作用和PANC-1细胞相比差异无显著性，而PANC-1/SVVas细胞的增殖则明显受抑，这种抑制作用随时间延长而增加，与对照组相比具有统计学差异（P<0.05）。
2.3 细胞凋亡核染色 荧光显微镜下观察，可见PANC-1/SVVas细胞的细胞体积变小，细胞核皱缩呈致密浓染或碎裂成块状，而PANC-1/neo、PANC-1细胞的细胞核呈蓝色且形态正常，参见图3。
3 讨论
胰腺癌是一种常见的恶性肿瘤，预后极差，严重影响着人们的生活质量，针对胰腺癌的化疗、放疗等治疗方案因各有其缺点而不能得以根治。肿瘤分子生物学观点认为，人类胰腺癌的发生和发展与人体众多的癌基因异常表达导致胰腺细胞的无限制生长、分化受阻及凋亡障碍有关。Surˉvivin是细胞凋亡的重要调控基因，其过度表达使细胞凋亡明显减少 ［3］ 。Survivin在胰腺癌病人及细胞系中都有不同程度的表达，并与胰腺癌的病程发展、预后及复发相关。自1984年Izant和Weitraub ［4］ 首次提出反义RNA可以抑制基因的表达，影响细胞的生物代谢以来，反义核酸技术的研究有增无减，近年又以其作为一项新基因治疗方式和途径受到人们的广泛关注，其主要作用机制是可以特异性地封闭靶基因，从而影响和调节靶基因表达的功能。Surˉvivin具有独特的组织分布，即仅表达在胚胎发育组织和人类大多数肿瘤中，而又与肿瘤的发生及肿瘤化疗耐药有密 切关系 ［5，6］ ，因此抑制survivin基因或蛋白的表达将不会对机体产生较大影响，这也就为进行基于survivin的反义治疗提供了前提条件。
本实验中，利用已构建的survivin反义核酸载体，通过电转染转入PANC-1细胞中，可特异封闭survivin基因的表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，不仅具有传统方法所不可替代的优势，而且也可为survivin反义基因治疗最终走向胰腺癌的临床治疗进行了积极的探索。
（本文图片略）
参考文献
1 Robert AO，Paula SW，Bettina SH，et al.A novel antisense oligonuˉcleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapy.Cancer Res，2000，60:2805-2809.
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基金项目:本课题受内蒙古自然科学基金资助（编号:200308020605）
作者单位:1 010059内蒙古医学院微生物免疫教研室
2 内蒙古医学院一附院妇产科
3 内蒙古农业大学医院