反义核酸抗肝炎病毒研究进展

　　摘要　病毒性肝炎的治疗一直是困扰人类的一个难题。目前可利用的药物仍屈指可数．反义核酸技术的发展为病毒性肝炎的治疗带来了新的希望。利用反义DNA，反义RNA和核酶技术来抑制乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒，在体外已进行了大量的研究，体内也进行了一些研究，为临床应用反义核酸治疗病毒性肝炎奠定了基础。

　　关键词　反义核酸，抑制，肝炎病毒学

　　科分类号　Q75，R512.6

　　病毒性肝炎是人类与其长期抗争的恶魔，迄今已发现有7种类型。由于病毒性肝炎的传染性强，尤其是乙型及丙型病毒性肝炎可形成慢性感染，造成肝细胞的持续损伤，加重肝脏病变，常导致病情反复发作，长期迁延不愈，部分病人可发展成肝硬化和肝癌，危害极大。近年来，对病毒性肝炎的研究有较大的进展，但能有效治疗病毒性肝炎的临床药物仍屈指可数，尤其是对慢性乙型及丙型病毒性感染，临床可用的药物仍是各型干扰素，对有选择性的病人来说，其治愈率也只有30％～40％［1］。因此寻找一种有效的抗肝炎病毒药物已成为迫在眉睫的问题。

　　由于病毒的遗传物质不同于宿主细胞，从基因治疗的角度去发现新的抗病毒药物已成为近几年来的研究热点。反义核酸技术是一种新的基因治疗技术，包括反义寡核苷酸（ASON），反义RNA（asRNA）及核酶三大部分。反义寡核苷酸是一段反义的DNA序列，能与特异性的靶序列互补，抑制靶基因的表达。由于它特异性强，毒副作用小而成为人们研究抗病毒药物的热点。近几年来已有几种抗病毒反义寡核苷酸药物进入临床试验阶段。反义RNA是指一段与mRNA互补的RNA分子，是通过将正常cDNA反向插入到启动子下游后转录产生的。核酶是一种小的RNA分子，能以序列特异的方式在特定的位点断裂RNA分子，从而阻断特异蛋白的表达。核酶的抗病毒作用也引起了研究者的广泛兴趣和关注。本文主要对近几年来应用反义寡核苷酸，反义RNA和核酶技术抗肝炎病毒的研究进展作一简要综述。

　　1　反义核酸抗乙型肝炎病毒

　　病毒性乙型肝炎（HBV）以其感染面广，慢性化和难以治愈而成为临床治疗的难点。目前，全世界约有3亿人感染HBV，我国乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的携带率占全国人口的9.8％，占全世界感染者的1／3强。干扰素是目前临床上唯一可用于治疗HBV感染的药物，但治疗效果不好，随着反义寡核苷酸技术的产生和发展及对HBV基因结构，功能和复制等主要环节的认识和了解，应用ASON来抑制HBV基因的复制和表达在体外已进行了大量的研究，体内也进行了一些研究。体外研究主要采用转染了HBVDNA并能长期稳定分泌病毒的肝癌细胞系进行的（HepG2，Huh7等）。分别针对HBV基因的吸附、转录、反转录、翻译和包装等阶段设计出各类ASON，体外抑制HBV的复制．主要的靶部位有PreS、DR1、Pol、SP启动子转录mRNA帽区、S基因、C基因、PolyA增强信号区、RNA前导序列等，针对这些部位设计的ASON均能不同程度的抑制HBsAg，HBeAg或HBcAg的表达，对病毒DNA也具有不同程度的抑制作用［2，3］。Korba等［4］针对以上不同部位合成了56条不同的硫代ASON（14～23nt），分别检测了它们对HepG2.2.15细胞中HBsAg，HBeAg，HBcAg及HBVDNA的抑制效果，结果表明：包含S基因起始编码子的ASON均能有效抑制HBsAg的产生和病毒颗粒的释放，但不影响细胞内HBV的复制；针对C基因的ASON能抑制病毒颗粒的产生和细胞内HBcAg和HBVDNA复制中间体的水平；针对HBV包装信号的茎环结构上游的ASON能最有效的抑制HBV的复制，但针对HBeAg和HBV聚合酶基因区的ASON却不能影响HBV的复制。Goodarz等［5］针对HBV基因S区的5个位点（SP2启动子转录mRNA帽区，Pre-s2基因内部，S基因翻译起始区，S基因起始区下游10个碱基区和S基因内部）设计了6段ASON，以17.4μmol／L的终浓度与PLC／PRF5共同孵育72h后检测HBsAg的分泌量，结果发现，针对前4个位点设计的ASON对HBsAg有明显的抑制作用，其中以S基因翻译起始区的作用最强，抑制率达96％。我国姚志强等［6］的研究也表明针对HBVmRNASP2增强子帽区，polyA增强信号区的硫代ASON能有效抑制HBsAg的产生，抑制率达85％～90％，对HBeAg的抑制率也近50％～60％。国内还有其他一些单位也展开了类似的工作。由于缺乏一个很好的动物模型，对抗HBV反义寡核苷酸的体内作用研究进展较慢。1993年，Offensperger等［7］第一次用针对PreS基因5′区的反义寡核苷酸AS2以20μg每克体重的剂量腹腔注射到鸭肝炎病毒（DHBV）感染的北京鸭中，连续10d，DHBV的复制几乎被完全抑制，血清中的DHBsAg及肝中的HbcAg也消失了。Moriya［8］等用一个转染了的HBVX基因的肝癌小鼠做模型，将一段含HBVX基因起始编码子的硫代ASON腹腔注射到小鼠体内，每周3次，连续8周，能有效的抑制肝脏HBVX基因的表达，阻止小鼠癌细胞恶性化。这一研究表明针对HBVX基因的ASON也许可用于阻止HBV感染成肝癌。

　　ASON的稳定性及透膜性是影响ASON作用的一个重要因素．通过对ASON进行各种化学修饰能有效地提高它在细胞内的稳定性，这些修饰主要是对磷酸二酯键中的氧原子进行各种取代，包括用硫基、甲基、甲氧基、乙氧基等取代，以提高ASON对核酸酶的抗性，硫代是目前最常用的修饰方式。ASON的透膜性直接影响到细胞摄入ASON的量，因而是目前进行ASON研究的一个热点。在肝细胞的表面有独特的无唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R），将ASON连接到ASGP-R配体上，能定向地将ASON导到肝细胞，增加肝细胞对ASON的摄取量［9］。目前人们已对许多肝细胞特异的ASON载体进行了研究［10］，这为更进一步地进行反义寡核苷酸的体内和临床研究奠定了基础。由于反义RNA能在转染的细胞中连续、稳定地表达，对整合的病毒能提供长期的