顺铂诱导胰腺癌细胞凋亡抑制蛋白Survivin表达的实验研究

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    【摘要】   目的   体外研究化疗药物顺铂诱导胰腺癌细胞株（Panc-1）胞内凋亡抑制蛋白Survivin的表达变化，探讨Survivin在胰腺癌化疗抵抗中的作用机制。方法   用人胰腺癌细胞株Panc-1株进行培养传代；MTT实验检测顺铂以不同浓度和不同时间对Panc-1株生长的抑制作用；用RT-PCR检测凋亡过程中Survivin基因表达的动态变化。结果   顺铂可明显抑制Panc-1细胞增殖，其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性；DNA电泳可以观察到凋亡的发生，而且呈药物浓度、作用时间依赖关系；Survivin表达水平随着顺铂作用浓度的增加而下降，当顺铂浓度为50μg/ml时下降最明显(61%)；Survivin cDNA/β-actin cDNA比值与细胞增殖抑制率和细胞凋亡率呈负相关（P<0.01）。结论   顺铂可以有效诱导Panc-1株的细胞凋亡，而且Survivin基因的抑制在顺铂诱导Panc-1株的细胞凋亡中起重要作用。

　　【关键词】   Survivin； 顺铂；胰腺癌； 凋亡

　　Apoptosis protein of survivin expression induced by cisplatin in cell of pancreatic cancer

　　ZOU Jie,GUO Kai-wen,TANG Chao-hui.

　　Department of Oncology,the Second Hospital of the Wuhan Steel Company,Hubei 460085,China

　　【Abstract】   Objective   To study the expression of survivin induced by cisplatin in Panc-1 cells in vitro, so as to provide the role of survivin on the mechanisms of chemotherapy drug resistance. Methods   The pancreatic cancer cell line Panc-1 was chosen in this experiment. The inhibitory effects of chemotherapeutical drugs on Panc-1 cell line were assayed with MTT test. The cisplatin group were divided into different groups by concentration and time. Expression of survivin detected by RT-PCR. Results   Cisplatin obviously inhibited the Panc-1 cell growth with dose- and time-dependent. Occurrence of apoptosis was detected by DNA electrophoresis staining in a dose- and time-dependent manner. Survivin expression was decreased with increasing of cisplatin concentration,its maximum effect was achieved at a concentration of 50μg/ml,at which mRNA was down-regulated by 61%.The ratio of survivin and β-actin was negatively with the inhibitory rate of cell proliferation and the rate of apoptosis, P<0.01.Conclusion   Cisplatin can effectively induce apoptosis in Panc-1 cells and the inhibition of survivin gene expression may play a critical role on the Panc-1 cell apoptosis induced by cisplatin.

　　【Key words】   survivin；  cisplatin ；  pancreatic cancer； apoptosis

　　目前常用的化疗药物有：顺铂(cisplation,DDP)、紫杉醇(taxol) 、卡铂(carboplatin) 、氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu) 、长春新碱(vineristin) 、丝裂霉素(mitomycin,MMC)等［1］。其中顺铂是美国癌症研究所建议的首选药物，但对顺铂作用机制的研究较少［2］。生存素(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)的新成员，可抑制Caspase级联反应下游的Caspase 3、7［3］，拮抗化疗药物诱发的细胞凋亡。本研究拟检测在顺铂作用下胰腺癌细胞株Panc-1胞内Survivi表达的变化，为探讨胰腺癌的化疗耐药机制及其在增强胰腺癌细胞化疗敏感性作用奠定基础。

　　1   材料与方法

　　1.1   试剂与细胞株   顺铂（齐鲁制药厂）；TRIzol RNA分离试剂（GIBCO公司）；TUNEL检测试剂盒（德国宝灵曼公司）；PCR引物（上海博亚公司）；Taq DNA聚合酶、逆转录试剂盒、DNA Marker、Rnase A（晶美公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）、SDS、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；Panc-1株（本室保存）。

　　1.2   化疗药物诱导Panc-1细胞凋亡   采用常规方法培养Panc-1细胞于孵箱内。每2～3天换液传代，取对数生长期的Panc-1细胞（1×106个/ml）分为实验组和对照组，实验组分别加入不同终浓度的顺铂：0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml［2］孵育24h。采用MTT法进行细胞增殖抑制实验；参照试剂盒说明，采取TUNEL法检测凋亡细胞。对照组不加药物，每组重复3次。此外，在顺铂浓度为20μg/ml条件下，分别孵育6h、12h、24h和48h，计算细胞增殖抑制率和凋亡率。按下列公式计算顺铂对Panc-1细胞的抑制率：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%。

　　1.3   DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡   1×106细胞在含50μg/ml顺铂的培养液中培养12h，离心沉淀后，加入细胞裂解液（1% NP40，20mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L Tris-cl pH7.5），离心取上清加入10%SDS、蛋白酶K，50℃孵育2h，再加入RNase A室温放置1h。酚、氯仿抽提，取10μl DNA， 70℃放5min后，15ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶，4V/cm电泳3h，观察结果并照像保存。

　　1.4   RT-PCR检测Survivin mRNA表达变化   收集上述各组细胞收集1×106个细胞，提取总RNA逆转录成cDNA，进行PCR反应检测Survivin mRNA的表达。引物序列为，上游引物：5-CATGGGTGCCCCGACGTT-3’，下游引物：5-TCAATCCATGGCAGCCAGCT-3’，并以β-actin为内参照，扩增片段长度313ｂｐ。反应条件：94℃预变性5ｍｉｎ，94℃变性1ｍｉｎ、50℃退火45ｓ、72℃延伸1ｍｉｎ，共30个循环,最后延伸10ｍｉｎ。产物经20ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照保存。

　　1.5   统计学方法   以上实验重复3次，部分数据以平均数±标准差(x±s)表示，采用SAS 软件进行统计分析。

　　2   实验结果

　　2.1   顺铂对Panc-1细胞的增殖抑制作用   不同浓度顺铂孵育24h后，Panc-1细胞增殖抑制率见表1，随着顺铂浓度的增加而增加。20μg/ml顺铂不同时间的细胞增殖抑制率(x±s)分别是6h为10.82±2.02%，12h为18.82±1.73%，24h为22.87±2.85%，48h为32.50±7.26%，并随时间的延长而增加，开始增加较快，然后逐渐减慢。

　　表1   不同浓度顺铂的作用结果   (略)

　　2.2   顺铂诱导Panc-1细胞DNA片段的变化   DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图1、2显示：20μg/ml顺铂作用6～48h后，均出现DNA ladder，而且 DNA ladder的量越来越多，不同浓度顺铂作用于Panc-1细胞24h后，10～100μg/ml的顺铂可致DNA规律性降解，出现DNA梯状图谱，而对照组和1ng/ml处理组未见DNA ladder形成。这反映了顺铂作用Panc-1细胞时导致了不同于坏死的DNA降解，即顺铂诱导细胞凋亡可能是抗肿瘤机制之一。

　　2.3   顺铂对Panc-1细胞Survivin mRNA表达的影响   取等量的RNA经RT-PCR分别检测Survivin和β-actin的mRNA表达，图3表明相同的细胞在顺铂诱导出现凋亡前后，内对照β-actin的mRNA表达无明显变化，而Survivin的mRNA在诱导凋亡早期即出现表达的减弱，Survivin表达水平随着顺铂作用浓度的增加而下降，当顺铂浓度为50μg/ml时下降最明显（见表1和图3）。

　　图1   20 μg/ml顺铂作用Panc-1细胞不同时间的DNA电泳结果(略)

　　图2   不同浓度顺铂作用Panc-1细胞的DNA电泳结果（24h）(略)

　　图3   不同浓度顺铂对Panc-1细胞Survivin mRNA表达的影响（24h）(略)

　　2.4   Survivin mRNA表达与顺铂的增殖抑制、凋亡诱导的关系   不同浓度的顺铂与Panc-1细胞共同培养24h，细胞增殖明显受抑并被诱导凋亡，同时Survivin表达下降，细胞增殖抑制率和细胞凋亡率随着顺铂浓度增加而增加，而Survivin cDNA/β-actin cDNA比值随着顺铂浓度增加而下降。由表1可见，细胞增殖抑制率和细胞凋亡率之间存在平行关系，这说明顺铂不但可以抑制细胞增殖，还可以诱导肿瘤细胞凋亡，而且这两个过程是同时进行的，而Survivin cDNA/β-actin cDNA比值与细胞增殖抑制率和细胞凋亡率呈负相关（P<0.01）。

　　3   讨论

　　凋亡抑制蛋白家族（IAPs）是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族［3，4］，这一家族的作用远远大于bcl-2家族的作用，其中Survivin是迄今为止克隆出的最小IAP，可抑制Caspase级联反应下游的Caspase3、7，发挥抗凋亡作用。但是，人们对化疗药物下游事件即启动凋亡级联反应的认识远不及化疗药物的生化机制清楚，在细胞凋亡过程中存在多种基因的调控作用，与凋亡密切相关的基因有Survivin、p53、bcl-2等，这些基因在化疗药物诱导肿瘤凋亡过程中的变化及如何影响肿瘤细胞耐药性的产生目前尚无一致结论。本研究通过化疗药物顺铂对细胞凋亡的作用及其引起Survivin表达的变化，探讨了细胞凋亡与化疗耐药的关系。Panc-1细胞存在多种凋亡相关基因的异常调控［5］，同时具有异常的Survivin活性，因此笔者运用顺铂诱导Panc-1细胞凋亡作为研究凋亡前后Survivin基因表达变化的模型。本研究发现Panc-1细胞经顺铂处理后，不论是高浓度还是低浓度均有不同程度的抑制，尤其是50μg/ml的顺铂作用24h后，Survivin基因表达抑制达到61%。同时发现顺铂可诱导Panc-1细胞凋亡，DNA琼脂糖凝胶电泳后出现DNA梯状图谱，随着作用时间的延长，凋亡细胞数逐渐升高，DNA ladder逐渐形成。6、12、24、48h在1～100μg/ml间随药物浓度增加凋亡细胞数逐渐升高，说明凋亡发生和药物浓度、作用时间呈依赖关系，而药物浓度的依赖性更明显。在顺铂诱导的Panc-1细胞凋亡过程中，发现Survivin基因表达的下调，在顺铂浓度为50μg/ml时下调最明显，顺铂浓度增加到100μg/ml时，虽然细胞生长抑制率和细胞凋亡率均增加，但Survivin基因的表达并不继续下调，其原因可能是顺铂除了通过Survivin途径，还可通过bcl-2、p53基因等其他途径诱导细胞凋亡。由此表明，化疗药物顺铂通过抑制凋亡抑制蛋白Survivin基因的表达而达到促进凋亡的作用，从而抑制细胞的生长。综上所述，诱导细胞凋亡是化疗药物治疗胰腺癌的重要机制之一，Survivin是调节胰腺癌细胞凋亡率的重要因素，细胞凋亡率和Survivin表达可作为临床上对胰腺癌患者进行化疗方案药物选择、预后评价的参考指标。针对胰腺癌细胞高表达Survivin的特点，可将其作为胰腺癌生物治疗的靶点。利用Survivin的反义核酸技术可使肿瘤细胞凋亡增加，抑制细胞增殖，降低细胞凋亡的阈值，增强对化疗药物的敏感性，减轻其毒副作用，从而为胰腺癌的治疗提供一条新的思路。

　　【参考文献】

　　1   Ocana A, Hortobagyi GN, Esteva FJ. Concomitant versus sequential chemotherapy in the treatment of early-stage and metastatic breast cancer. Clin Breast Cancer, 2006,6(6):495-504.

　　2   Sekiguchi I, Suzuki M, Ohwada M, et al. Apoptosis as a criterion for sensitivity of uterine cervical adenocarcinoma to cisplatin. Oncol Rep,1998，5(5):1077.

　　3   Devereaux QL, Takahashi R, Salvesen GS, et al. X-linked IAP is a direct inhibitor of cell-death proteases. Nature 1997， 388: 300-304.

　　4   Altieri DC, Marchisio PC, Marchisio C. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest, 1999, 79(11):1327.

　　5   Shore S, Raraty MG, Ghaneh P, et al. Review article: chemotherapy for pancreatic cancer. Aliment Pharmacol Ther， 2003，18(11-12):1049-1069.

　　(编辑：齐   永)

　　作者单位： 460085 湖北武汉，武汉钢铁公司第二医院肿瘤科

　　430081 湖北武汉，武汉科技大学医学院

　　430030 湖北武汉，华中科技大学同济医院