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3 蛋白酶
3.1 致病性 Vv蛋白酶是609个氨基酸残基组成的分子量为45KD、等电点为5.8的蛋白质,对热、pH、重金属盐等敏感。由2个功能区组成,一个N-末端的35KD多肽,是蛋白酶活性区,而C-末端的10KD多肽是底物连接区。Miyoshi等 [9] 以纯化的蛋白酶注射入豚鼠背部引起广泛的皮下出血、水肿,其主要机制为蛋白酶降解血管内皮基底膜的IV胶原纤维,导致血管壁变薄、破裂而致出血。Jeong等 [10] 构建蛋白酶缺失突变株并攻击小鼠,发现对皮下组织、肝脏系统的破坏力都没有受到影响,也没有影响到对上皮细胞INT407的溶解能力,认为蛋白酶在Vv致病过程中的作用并不重要,这是因为Vv产生多种毒力因子,单独蛋白酶的缺失可能被其它毒力因子所弥补。台湾学者 [11] 采用等位基因交换技术产生蛋白酶缺失突变株(protease-deˉficient,PD),发现PD通过腹腔攻击小鼠时,其毒力和亲株无明显区别,而经口攻击时,其毒力反而是亲株的10倍多。PD株液体培养上清液中的细胞溶素浓度比野生株高出两倍多,这可能与经口感染时PD株毒力增强有关。
3.2 分子生物学研究 Vv蛋白酶基因表达高峰在对数生长末期 [12] ,其表达受LuxR同簇体SmcR的调节,它不但正调节蛋白酶基因,而且还可能负调节细胞溶素基因,因为SmcR的突变导致蛋白酶缺失的同时细胞溶素表达水平显著升高。研究 [13] 表明调节是在转录水平,其转录引物从2个不同位点开始延伸,形成2个促进子PL和PS,PL的活性较PS低,在对数生长期和稳定期都能持续保持活性,不受crp或rpoS(产物为σ因子s)突变的影响,PS的转录只出现在稳定期,并且依赖于rpoS,crp的突变减少PS的活性,crp的灭活并不影响rpoS突变株的PS活性,crp需要通过rpoS执行其调节效果。H lsmann等 [14] 构建的rpoS突变株在各种环境压力下的生存能力减弱,包括对双氧水,高渗透压和酸的抵抗能力。多种蛋白酶活性缺失或降低,表明rpoS对于Vv适应环境变化很重要。
4 铁载体
4.1 致病性 铁是大多数细菌生长必需元素,Vv毒力分离株合成铁载体,能竞争性结合细胞内的结合铁,形成复合物,再通过Vv表面的铁载体受体,转运到菌体内部利用。无毒分离株不能产生铁载体,所以不能有效利用宿主及环境中的铁源,其生长繁殖缓慢。在Vv致病性方面,铁的利用显得特别重要。铁过载是比免疫损伤对Vv感染更有意义的风险因素。Vv原发性败血症通常与铁过载疾病相关。
在Vv的致病性研究的实验中,常用右旋糖酐铁预注射的小 鼠作为动物模型,增加对Vv的易感性。
4.2 分子生物学研究 Webster等 [15] 采用TnphoA插入突变产生不能利用转铁蛋白的Vv,发现其铁载体合成障碍,致使对乳鼠毒力减低。插入位点于ORFvenB,其产物与铁载体的合成密切相关。许多铁调节基因的表达能够被一种铁结合抑制蛋白Fur(ferric uptake regulation)所抑制。fur缺失突变导致72KD和77KD的两种铁调节外膜蛋白缺失表达,77KD的铁调节蛋白基因已经克隆出,其纯化产物前15个氨基酸残基与霍乱弧菌的亚铁血红素受体(HutA)具有67%的同源性。Vv的亚铁血红素受体(HupA)基因是一个编码712个氨基酸残基的ORF。hupA等位交换,导致77KD蛋白质的表达缺失,不能以血红素或亚铁血红素作为铁源。HupA促进子在转录水平受铁浓度的有力调节。从Vv纯化分离的72KD铁调节外膜蛋白N-末端氨基酸序列与HutA成熟蛋白前15个氨基酸有53%的同源性,HupA突变导致72KD蛋白质表达缺失,不能利用转铁蛋白或铁载体作为铁源。导入含有完整HupA及342bp的上游序列,能够恢复对转铁蛋白或铁载体的利用能力。最近研究 [16] 揭示,RpoS和Fur分别是Vv在稳定生长期和低铁环境下生存起重要作用的转录调节子。在确定RpoS对fur基因的调节同时,发现Fur也是RpoS的调节子成员,尤其是Fur的表达在RpoS突变株中严重受损,提示RpoS与Fur合成有关。fur表达调节是RpoS和Fur相互作用网络调节。
5 结语
Vv的致病物质是多样的,除上述的以外,还有磷脂酶、IV型链肽酶和脂多糖。其中任何一种物质毒性都是非常强烈的,而它们之间又协同作用,导致快速疾病进程和高死亡率。CPS和LPS诱发宿主机体产生TNF-α、IL-1等内源性热源质作用于体温调节中枢,引起发热。尤其是TNF-α和IL-1β、IL-6、IL-8等前炎症细胞因子的瀑布级联放大作用,引起宿主细胞、组织坏死,最终多器官衰竭死亡。随着分子生物学技术的发展,对Vv致病性研究不断深入到基因表达、调控水平,整个Vv基因组测序工作已完成,对每个基因的功能也正在研究之中。同时,许多学者正在研究宿主机体和Vv致病物质之间的相互作用,包括败血症过程中的各种前炎症细胞因子的动态变化以及它们之间的相互调节关系,并以此为基础探讨Vv感染的预防和治疗。
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作者单位:325003浙江省温州医学院