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Huang Dinan，Hou Gan，Liu Wance
Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical College，Zhanjiang Guangdong524023.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Ginkgo biloba extract EGb761on apoptosis of Hela cell induced by tumor necrosis factor-α（TNF-α）and on the activity of caspase-8.Methods Flow cytometry was used to detect the effect of EGb761on the apoptosis of Hela cell induced by rhTNF-αand caspase-8fluorescent kits was used to detect the activity of caspase-8.Results The result of flow cytometry exhibited that EGb761with10～40mg/L final concentration had notable inhibition but not absolute inhibition on the apoptosis of Hela cell induced by rhTNF-α（P<0.01）and it showed dose-dependence.The detection of the activity of caspase-8showed that EGb761with10～40mg/L final concentration also had notable inhibition on the caspase-8activation of Hela cell inˉduced by rhTNF-α（P<0.01）.Conclusion The inhibition of apoptosis in Hela cell induced by rhTNF-αby EGb761may have relation to the caspase-8activation.
Key words tumor necrosis factor-α EGb761 Hela cell apoptosis caspase-8
已往的研究表明，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）在体外能诱导某些正常细胞和包括Hela细胞株在内的大多数肿瘤细胞株凋亡 ［1］ 。TNF-α诱导敏感细胞凋亡的机理，被认为是通过与靶细胞膜上的特异性受体（TNF-Rs）结合后，触发细胞内信号转导而启动凋亡机制 ［2］ 。TNF-α以活性三聚体与细胞表面的TNF-R1结合，引起TNF-R1形成三聚体，三聚的TNF-R1通过其凝集的胞内死亡结构或招募下游的信号传递蛋白，如TRADD（TNF receptor-associated death domain）、FADD（Fas receptor-associated death domain）、TRAF2（TNF receptor-associated factor3）和RIP（reˉceptor-interacting protein）等组装成庞大的信号传导复合体，进而激活下游的多条信号传递通路。其中FADD通过活化Caspase-8引发细胞凋亡 ［3］ 。本文观察了银杏叶提取物EGb761（Ginkgo biloba extract，EGb761）对TNF-α诱导Hela细胞凋亡和Caspase-8活性影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 RPMI-1640培养基（Gibco公司产品），小牛血清（超级，为杭州四季青生物工程公司产品），重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）、碘化丙啶（PI）（美国Sigma公司产品），EGb761为南京博瑞公司产品，Caspase-8荧光检测试剂盒和Caspase-8抑制剂IETD-FMK（Clontech公司），余为国产分析纯试剂。
1.2 细胞培养与细胞株 Hela细胞株引自中国科学院上海细胞生物研究所。培养基为含10%小牛血清及青霉素（100U/ml）、链霉素（50μg/ml）的RPMI-1640培养基，于37℃、5%CO 2 条件下培养。
1.3 流式细胞仪分析 取对数生长的Hela细胞，实验分为5个组:空白对照组、rhTNF-α（100μg/L）组、rhTNF-α（100μg/L）+EGb761（10mg/L）组、rhTNF-α（100μg/L）+EGb761（20mg/L）组和rhTNF-α（100μg/L）+EGb761（40mg/L）组，培养48h;参照Nicoletti等 ［4］ 的方法进行流式细胞术分析，RNA酶处理后进行PI染色，采用EPICSXL型流式细胞仪检测亚倍体峰。重复3次实验。
1.4 Caspase-8活性的检测 实验分为5个组，分组及药物处理同上，培养48h;另外5个相同的药物处理组同时加IˉETD-FMK（caspase-8抑制剂），培养48h;然后均按Clontech公司的caspase-8荧光检测试剂盒操作说明检测caspase-8活性。用荧光分光光度计检测IETD-AFC中游离的AFC（7-amino-4-trifluo-rometheyl coumarin）的强度，以此来确定caspase-8的活性。按Clontech公司的caspase-8荧光检测试剂盒操作说明严格检测。绘制标准曲线，计算出caspase-8活性。
1.5 统计学方法 所有数据均以ˉx±s表示，利用SPSS软件进行统计学处理，行方差分析及Tukey’s HSD检验。
2 结果
2.1 流式细胞术分析细胞凋亡结果 rhTNF-α处理的各组，DNA直方图均可见到明显的亚二倍体峰（sub-G1峰），以亚倍体细胞峰代表凋亡率，结果见表1。结果显示，rhTNF-α（100μg/L）处理组细胞凋亡率显著增高（P<0.01）;不同浓度EGb761对rhTNF-α诱导的Hela细胞凋亡均有显著的抑制作用（P<0.01），且随着EGb761剂量的增加，呈剂量依赖关系。但不同浓度EGb761组与空白对照组比较差异有非常显著性（P<0.01），表明EGb761未能完全抑制rhTˉNF-α诱导的Hela细胞凋亡。
2.2 caspase-8活性的变化 各组caspase-8活性测定结果见表2。结果显示，rhTNF-α（100μg/L）处理组，caspase-8活性较空白对照组显著增高（P<0.01）;不同浓度EGb761 对rhTNF-α（100μg/L）诱导的caspase-8活性均有显著的抑制作用（P<0.01），且随着EGb761剂量的增加，呈剂量依赖关系。但不同浓度EGb761组与空白对照组比较差异有非常显著性（P<0.01），表明EGb761未能完全抑制rhTNF-α诱导的caspase-8活化。用IETD-FMK（caspase-8抑制剂）后，除对照组外，各组caspase-8活性明显下降，抑制剂组与对应的实验组比较差异有非常显著性（P<0.01）。
表1 流式细胞术分析细胞凋亡结果 （略）
注: 1） P<0.01，与对照组比较; 2） P<0.01，与rhTNF-α组比较
表2 caspase-8活性结果 （略）
注: 1） P<0.01，与对照组比较; 2） P<0.01，与rhTNF-α（100μg/L）组比较; 3） P<0.01，与对应的无抑制剂IETD-FMK组比较
3 讨论
银杏叶提取物EGb761是从银杏科植物叶子中提取的一种含有多种有效成分混合物，其主要有效成分为黄酮糖苷类（24%）和萜烯内酯类（6%），具有较强的抗氧化作用 ［5］ 。许多研究显示EGb对自由基和缺血再灌注引起的心、脑细胞损伤有保护作用，并且这种保护作用被认为与抗细胞凋亡有关。Xin等 ［6］ 报道银杏叶提取物能减轻神经细胞凋亡。Smith等 ［7］ 的实验表明EGb能上调PC12细胞的Bc12表达，抑制caspase-3激活，下调caspase-12，减少细胞色素C释放和DNA断裂，减少细胞凋亡发生。本文的研究结果显示，EGb761在10～40mg/L终浓度范围内对rhTNF-α诱导的Hela细胞凋亡有显著的抑制作用（P<0.01），且呈剂量依赖关系。这一结果表明，EGb能有效地抑制rhTNF-α诱导的Hela细胞凋亡，与上述有关EGb抗细胞凋亡的报道一致。
现在普遍认为细胞凋亡是一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶caspase在凋亡不同阶段发挥作用，分为调控性casˉpase和效应性caspase，形成凋亡信号传导的酶级联反应 ［8］ 。在本研究中，我们用caspase-8荧光检测试剂盒检测调控性caspase-8在EGb761对rhTNF-α诱导的Hela细胞凋亡发挥抑制作用时的活性变化，结果表明EGb761对rhTNF-α 诱导的caspase-8活性升高具有抑制作用，并呈剂量依赖关系。同时用IETD-FMK（caspase-8抑制剂）处理，caspase-8活化被抑制，EGb761处理各组caspase-8活性差异无显著性，表明rhTNF-α诱导的Hela细胞凋亡过程caspase-8确实被活化了。我们推测，EGb761对rhTNF-α诱导的Hela细胞凋亡的抑制作用，可能与其活化caspase-8，最终形成凋亡信号传导的酶级联反应有关，其确切机制尚有待进一步探明。
参考文献
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作者单位:524023湛江广东医学院生物化学与分子生物学研究所