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【摘要】 目的 探讨天螺霜的理化性质及抗乙肝病毒作用效果。方法 采用溶剂提取法自江西巴蜗牛提取天螺霜，复溶精制后作初步定性试验。采集32例HBV-DNA阳性患者血清标本各2份，分别加入天螺霜(试验组)和蒸馏水(对照组)，37℃温箱中孵育3h后用PCR检测两组标本HBV-DNA含量。采用半体内法观察天螺霜对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响。 结果 天螺霜水溶液Pitrowsky试验阴性，碘液试验阳性，Molisch试验阳性。32例乙肝患者HBV-DNA体外实验观察结果显示，实验组、对照组阴转率分别为77.78%、0.00%，差异有显著性（P<0.01）。给药组和对照组吞噬百分率、吞噬指数分别为（61.7±4.73）％、0.89±0.071和（29.8±5.16）％、0.64±0.047，差异均有显著性（P<0.001）。结论 天螺霜为一类多糖物质，具有体外抑制乙型肝炎病毒复制的功能，可增强小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用。
【关键词】 天螺霜； 乙肝病毒； 吞噬功能试验
Preliminary study on physical and chemical characteristics and antihepatitis B virus function of Tianluopolysaccharides extract prepared from Jiangxinensis
ZHU Yuxia, TＩＡＮ Ye, ZＨＡＮＧ Chao,et al.
School of Medicine, Anhui University of Science & Technology, Huainan, Anhui 232001, China
【Abstract】 Objective To study on physical and chemical characteristics and antihepatitis B virus function of Tianluopolysaccharides extract prepared from Jiangxinensis. Methods The organic element was prepared from Bradybaena.Jiangxinensis by solvent extraction methods and was qualitatively analyzed by Pitrowsky test, iodine test and Molisch test. Then we observed the inhibition effect of Tianluopolysaccharide on hepatitis B virus duplication in vitro with the method of polymerase chain reaction (PCR). The test of murine macrophages exposed to Tianlopolysaccharides was also carried out to obtain some insight into the interaction between Tianluo-polysaccharide and the functions of mouse peritoneal exudate macrophages. Results (1) The extract from Bradybaena.Jiangxinensis was some white and granulosum material that is soluble in water but not in alcohol. (2) The results of Pitrowsky test, iodine test and Molisch test were negative, brownish red color and purplish red color, respectively. (3) As the results of polymerase chain reaction (PCR) of hepatitis B virus (HBV) DNA, positive balteum appeared in every sample of control group and only 8 positive balteum appeared in testing group (P<0.01). (4) The index of phagocytosis（IP）and percentage of phagocytosis in testing group and control group were （61.7±4.73）%,（29.8±5.16）％ and 0.89±0.071,0.64±0.047, respectively (P<0.001). ConclusionThe extract is initially identified as a polysaccharide material, and temporary named as Tianluopolysaccharide. In vitro test suggest that Tianluopolysaccharide exhibited antihepatitis B virus activity. The stimulation of phagocytic activity of macrophages was also proved by this study.
【Key words】 tianluopolysaccharides；hepatitis B virus；phagocytosis test
天螺汤系我国民间较常使用的以蜗、螺类动物为主药的中药方剂，药源材料常用天螺、蜗螺、田螺、扁螺等。主要用于治疗“黄疸、诸疸”及其他有湿热症候之疾患，在浙、苏、皖等地应用已久，对于病毒性肝炎的治疗具有较好的疗效。为探讨天螺汤有效成分及其抗乙肝病毒效果，我们进行多糖定性试验和病毒抑制试验，还采用半体内法实验（药理实验方法学）［1］观察了活性提取物对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 天螺霜 天螺采自淮河水系淮南段，经鉴定确认为江西巴蜗牛（Bradybaena. Jiangxinensis）。取鲜活江西巴蜗牛流水冲洗后脱壳、加水匀浆，加入36%乙酸至pH 5.0，加热10～20min，冷却后离心，于滤液中加入2倍量无水乙醇，取沉淀物，经复溶精制，得白色颗粒状结晶(暂名为天螺霜)。
1.1.2 研究对象及实验动物 临床上PCR－HBV DNA阳性患者血清标本32份（男16例，女16例），正常人血清标本32份（男16例，女16例）；体重18.31～21.15g（19.73±1.42）g的普通健康小白鼠30只（雌雄各15只）（安徽医科大学动物房提供）、公鸡（市售）。
1.1.3 仪器和试剂 基因扩增仪（TC1，美国Perkin Elmer公司）、高速冷冻离心机（TLL-C，北京四环科学仪器厂）、紫外荧光分析仪（2F，上海康华生化仪器厂）、Olympus光学显微镜（CHB-213-W，日本）、电热恒温水浴锅（H.H.SH11-8上海医疗器械五厂）等；PCR试剂由华美生物工程公司提供（批号：97.6.22）、4%姬姆萨-瑞特氏染色液、Aisever’s液、苦味酸液、生理盐水等。
1.2 方法
1.2.1 天螺霜成分鉴定 将天螺霜配制成1%水溶液后分别进行Pitrowsky实验［1］、碘液实验［2］、Molisch实验［2］以初步确定天螺霜的化学本质，并应用苯酚-硫酸法对其进行定量检测［３］。
1.2.2 HBV-PCR抑制实验［４］
1.2.2.1 标本处理 以浓度200μg/ml的天螺霜无菌水溶液对32份标本进行乙型肝炎病毒基因复制抑制试验，具体见表1。将天螺霜无菌水溶液加入Eppendorf离心管，以快速混匀器混匀、封口，37℃孵育3h，沸水浴20min，取出以14000r／min离心5min，留取上清液待用。
1.2.2.2 HBV-DNA检测 取出试剂盒中已分装有Taq酶的试管编号，加天螺霜组为实验组，未加天螺霜组为病例对照组，两组均设试剂阳性、阴性对照各一孔。各管依次加入HBV混合液26μl，液体石蜡30μl，再加入上述已处理过的上清液2μl，在混匀器上混匀，离心20s，放入基因扩增仪内94℃预变性5min。依次经94℃、45s，72℃、45s，55℃、45s，循环35次，延伸5min。扩增产物置紫外荧光分析仪上观察结果，出现与阳性对照一致者列为阳性。
1.2.3 巨噬细胞吞噬功能实验
1.2.3.1 鸡红细胞悬液的制备 无菌操作,鸡翼下静脉采血, 置100ml锥形瓶中, 加入相当于鸡血体积5倍的Alseve’s溶液混匀, 4℃冰箱贮存，使用时稀释成5%(V/V)应用液。
1.2.3.2 巨噬细胞吞噬功能实验方法 将30只小白鼠随机分成实验组和对照组。实验组小鼠每天灌胃给药0.5ml/只，对照组为等体积生理盐水，共14天。停药后2h每只小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液1ml，2h后将动物脱颈椎处死，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹腔皮肤，经腹腔注入生理盐水2ml，转动鼠板1min，然后用注射器抽出腹腔洗液1ml，平均分别滴于2片干净载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃温箱孵育30min后取出，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞，晾干后以1:1丙酮-甲醇液固定5min，再用4%姬姆萨-瑞特氏染色液染色3min，用蒸馏水漂洗、晾干。在油镜下每片计数巨噬细胞200个，按公式分别计算吞噬百分率和吞噬指数。
吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数 计数的巨噬细胞数(200)×100%
吞噬指数=(200个)巨噬细胞所吞噬鸡红细胞的总和 计数的巨噬细胞数(200)
1.3 统计学方法 采用χ2和t检验，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 一般性状 天螺霜为白色颗粒状晶体，易溶于水，不溶于乙醇。
2.2 成分鉴定 应用苯酚-硫酸法比色测定多糖含量；天螺霜水溶液Pitrowsky实验呈阴性，与稀释碘液作用呈红棕色，Molisch试验出现紫红色环，提示该物质系多糖类化合物。
2.3 HBV-DNA PCR抑制实验 结果如表1所示，病例对照组32例无一例转为阴性，实验组有24例转为阴性， 转阴率为77.78%，两者差异有显著性（P<0.01）。
2.4 巨噬细胞吞噬功能实验 结果如表2所示，用药组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数均高于对照组，差异有显著性（P<0.001）。
表1 乙肝病毒基因复制抑制试验 （略）
表2 天螺霜对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响 （略）
3 讨论
蜗、螺属动物类中药在我国具有较长的应用历史，明代李时珍《本草纲目》对田螺、蜗螺、天螺（缘桑螺、桑牛）、蜗牛、蛞蝓等药用功能和使用方法均有详细记载。天螺即缘桑赢，载《本草纲目》虫部，品种较多，但以江西巴蜗牛及灰巴蜗牛（Bradybaena ravida, Benson）为多见，李时珍称田螺具有利湿热、去黄疸之功效［５］。高士贤等也曾以田螺肉加茵陈等炖汤饮服，治疗黄疸［６］。以往文献虽对天螺汤的应用有所记载，但其对乙肝确切的治疗效果尚未完全阐明。
本研究以江西巴蜗牛为原料，经过分离提纯制得白色颗粒状结晶体即天螺霜，其水溶液Pitrowsky实验呈阴性，与稀碘液作用呈红棕色，Molisch实验出现紫红色环，提示该物质系一类多糖类化合物，具有易溶于水，不溶于乙醇的特点。以往文献关于多糖类物质抗乙肝病毒作用已有报道，刘建平等研究表明猪苓多糖具有阴转血清HBeAg和血清HBV-DNA效果［7］。Dienstag JL等研究发现，香菇菌多糖同时也具有抑制逆转录病毒的作用，且无不良反应［８］。本文研究结果显示病例对照组32例标本HBV-PCR无一例转为阴性，天螺霜用药组24例标本HBV-PCR结果为阴性，转阴率为77.78%，差异有显著性（P<0.01），提示天螺霜具有类似猪苓多糖、香菇多糖的抗病毒功效，可抑制乙型肝炎病毒DNA复制，促进肝细胞修复。
目前已有大量药理和临床研究表明，多糖类化合物是一种有效的免疫调节剂，具有激活免疫受体，提高机体的免疫功能等作用［9］，在病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有积极意义。如绞股蓝多糖能明显提高小鼠碳粒廓清速率，并增强肝癌Heps小鼠NK细胞活性，西洋参多糖在体外可促进脾淋巴细胞转化［1０，11］。尽管已有大量报道表明多糖能在激活淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞（NK）等免疫细胞，活化补体，促进细胞因子生成等方面对免疫系统发挥多方面的调节作用，但所研究对象大多为植物或微生物多糖，有关动物多糖对免疫系统影响的报道并不多见。巨噬细胞属机体的非特异性免疫细胞，是衡量机体非特异性免疫功能的主要指标，以往文献表明，乙肝病毒感染的临床表现与机体的免疫能力状态密切相关，采用中西医结合方法治疗乙型肝炎时应注意提高机体免疫力的问题［12，1３］，因此，可用巨噬细胞吞噬功能实验检测药物对机体防御能力的作用［14］。本研究通过计数小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，给药组和对照组吞噬百分率、吞噬指数分别为（61.7±4.73）％、0.89±0.071和（29.8±5.16）％、0.64±0.047，差异均有显著性（P<0.001）。本试验结果表明天螺霜可明显提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力，说明其对机体免疫细胞及应答活动产生有利影响，这种调节免疫的作用对于增强机体抵抗乙肝病毒是有重要意义的。
总之，本研究首次提取江西巴蜗牛的生物活性成分并对其理化性质作了初步研究，确定该提取物为一类多糖物质。经体外HBV-DNA PCR抑制试验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能实验证实了天螺霜有体外抑制HBV-DNA PCR及增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用。有关该物质的化学结构及其抗乙型肝炎病毒复制的确切机制尚待进一步研究。
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基金项目：安徽省自然科学基金资助(编号：2000j1222)
作者单位： 232001 安徽淮南， 安徽理工大学医学院(△通讯作者)
(编辑：秋 实)