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【摘要】 目的 探索研究水溶性维生素（维生素B1、维生素B6、维生素B12和维生素C）对体外小鼠淋巴细胞活化的作用。方法 采用改良的MTT法，来检测体外小鼠淋巴细胞活性。结果 VitB1 100μl（含0.005μg）、VitB6（12.5μl含0.000625μg）对体外小鼠淋巴细胞活性是明显的，VitC 25μl（含0.01μg）作用也是明显的。VitB１２则随浓度增高作用稍有增强，但差异无显著性。结论 结果显示VitB1、VitB6和VitC对小鼠淋巴细胞活性有增强作用。
【关键词】 水溶性维生素；MTT法；小鼠淋巴细胞
To use of water solable vitamins for studing the activation of in vitro mice lymphocytes
SUN Ming-jie, GAO Yan, WANG Ke, et al.
Department of Immunology,Capital University of Medical Sciences, Beijing 100069，China
【Abstract】 Objective We proposed to study the effecte of water solule Vitamins（Vitamin B1、Vitamin6、Vitamin12 and Vitamin C）in vitro mice lymphocytes.Methods We took the modified method of MTT to explose the activation or in vitro mice lymphocytes.Results VitB1 100μl（contain 0.005μg）、VitB6（12.5μl contain 0.000625μg）、stimualated the effect of in vitro mice lymphocytes which was obvious and VitaminC（25μl contain 0.01μg）） was manifested too.Conclusion Water solule Vitamins （VitB1、VitB6、VitB12 and VitC）were able to stimulate the ativation of in vitro mice lymphocytes under cerftain concentration.
【Key words】 water sobale vitamin； MTT method； mice lymphocytes
水溶性维生素包括B族维生素和维生素C，是维持人体正常生理机能和物质的能量代谢所必需的物质。当前许多国内外学者研究它们抗衰老、抗氧化和对胸腺的作用，企图阐明它们对机体免疫功能的作用。许多学者都涉及它们提高机体免疫力，但未见报道它们直接对淋巴细胞的作用。本文选用和人类基因组具有大量同源性小鼠的淋巴细胞，体外实验检测维生素B1、B6、B12和维生素C对小鼠血中淋巴细胞活性的作用。
Mosman（1983）［１］报道噻唑蓝（MTT）比色法，经后人改良，使这种方法更加完善，成为定量、重复性好、简便易行的检测淋巴细胞活性的好方法。我们采用此法，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1．1 实验动物和主要试剂及实验仪器 ICR小鼠，体重（20±2）g，雄性，由首都医科大学实验动物部提供。RPM 1640培养液为Hyclone公司产品，噻唑蓝（MTT）为Sigma公司产品，10%十二烷基磺酸钠（SDS）为BRL公司产品，淋巴细胞分离液为TBD生物技术发展中心产品，维生素B1（5mg/ml）、B6（5mg/ml）、B12（0.5mg/ml）均为天津金耀氨基酸有限公司产品，维生素C（400mg/ml）为北京双鹤药业有限公司产品，酶标仪为SLT公司产品（型号为A-5082）。
1．2 方法 （1）淋巴细胞的分离，从ICR小鼠（雄性）眼静脉采血，加入等量细胞分离液，低速离心，吸取淋巴细胞层，洗3次，立即进行淋巴细胞计数，4℃保存在RPM 1640培养液中待用。（2）噻唑蓝比色法，将制备的活的小鼠淋巴细胞分管，分别设实验管（孔）6管（孔），对照管6管（孔）。①VitB1实验组，每6管（孔）分别加入VitB1400μl（含0.02μg）（6孔）、200μl（含0.01μg）（6孔）、100μl（含0.005μg）（6孔），对照组每孔加入等体积的RPM 1640液（6孔）。②VitB6实验组，每6管（孔）分别加入VitB6 50μl（含0.0025μg）（6孔）、25μl（含0.00125μg）（6孔）、12.5μl（含0.000625μg）（6孔），对照组每孔加入等体积（含的RPM 1640液（6孔）。③VitB12实验组，每6管（孔）分别加入VitB12 400μl（含0.0002μg）（6孔）、200μl（含0.0001μg）（6孔）、100μl（含0.00005μg）（6孔），对照组每孔加入等体积的RPM 1640液（6孔）。④VitC实验组，每6管（孔）分别加入VitB6 100μl（含0.04μg）（6孔）、50μl（含0.02μg）（6孔）、25μl（含0.01μg）（6孔），对照组每孔加入等体积的RPM 1640液（6孔）。37℃温育2h后，每管（孔）加入20μl MTT（5mg/ml MTT溶于PBS pH 7.5），轻轻震荡后，37℃温育2h后，每管加10% SDS（溶于双蒸水），轻轻震荡，待甲簪颗粒完全释放，酶标仪测OD570值。
2 结果
2．1 VitB1对小鼠淋巴细胞活性的作用 VitB1对小鼠淋巴细胞活性的作用，随浓度增加，作用减弱，当VitB1 100μl（含0.005μg）对小鼠淋巴细胞活化作用有显著增强作用，P＜0.01（见图1）。
2．2 VitB6对小鼠淋巴细胞活性的作用 VitB6对小鼠淋巴细胞活性的作用，随浓度增加，作用减弱，当浓度为12.5μl（含0.000625μg）稍有增强作用（见图2）。
2．3 VitB12对小鼠淋巴细胞活性的作用 VitB12对小鼠淋巴细胞活性的作用，随浓度增高作用稍有增强作用，但不明显（见图3）。
图1 VitB1对小鼠淋巴细胞活性的作用（略）
图2 VitB6对小鼠淋巴细胞活性的作用（略）
图3 VitB12对小鼠淋巴细胞活性的作用（略）
2．4 VitC对小鼠淋巴细胞活性的作用 VitC对小鼠淋巴细胞活性的作用，随浓度升高，作用减弱，当浓度为25μl（含0.01μg）作用最强，P＜0.01（见图4）。
图4 VitC对小鼠淋巴细胞活性的作用（略）
3 讨论
Mosman（1983年）报道噻唑蓝（MTT）比色法测定细胞的活性。MTT可被各种类型的活细胞（RBC除外）摄取，活性强的细胞摄取较多的MTT，在线粒体内被脱氢酶还原为甲簪（Formazan），颜色由黄变深紫，加入SDS使细胞完全裂解，在波长570nm下酶标仪测量OD值，OD值越高，反应细胞活性越强［２，３］。因此，MTT法可定量测量细胞活性。此方法，经后人改良，更加完善，成为定量好、重复性好、简便易行的好方法。我们采用小鼠静脉血，分离出淋巴细胞。淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞，其中T细胞占70%左右。因此，我们测量的小鼠淋巴细胞活性，充分反应T淋巴细胞活性。结果显示，VitB1（100μl含0.005μg）,VitB6（12.5μl含0.000625μg）对小鼠淋巴细胞活性有显著增强作用。VitC在25μl（含0.01μg）、50μl（含0.02μg）、100μl（含0.04μg）均有显著增强小鼠淋巴细胞活性的作用，但随着VitC浓度增加，作用有稍减的趋势，但VitB12增强小鼠淋巴细胞活性不明显。VitB1、VitB6、VitB12均涉及体内的细胞正常生理生化功能，因此，它们也参与小鼠淋巴细胞生理、生化功能［４］。VitC维持细胞酶的活性，当然也影响淋巴细胞酶的活性，有报道VitC在淋巴细胞中浓度较高，当应激和感染时，淋巴细胞中VitC浓度降低。还有报道，VitC有增强NK细胞的活性，因此增强机体抗肿瘤的作用［５，６］。
国内许多学者均提到VitB1、VitB6、VitB12和VitC等水溶性维生素有增强固有免疫和适应免疫的功能。但至今未见报道它们直接对动物淋巴细胞活性增强作用的研究报道。本文初步阐明VitB1、VitB6 VitB12和VitC在体外对小鼠淋巴细胞活性有增强作用。这结果是否反应它们有对人的淋巴细胞活性增强作用，尚待再进一步研究。至于水溶性维生素不同浓度作用不同，体外实验受到pH值的影响。
【参考文献】
1 Mosmann T. Repid colorimetric assay for cellular growth and survirval Application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Meth，1983, 65：55-63.
2 陈哲生. 噻唑蓝比色法检测细胞的活性.上海医学检验杂志，1994，9（4）：205-206.
3 陈哲生. 噻唑蓝比色法用来研究人类淋巴细胞和小鼠巨噬细胞的活性.上海免疫学杂志，1992,12（5）：269-317.
4 荫士安，汪之琐.现代营养学.第八版.第4篇.水溶性维生素.北京：化学工业出版社，2004，213-285.
5 徐世侠，吴育云.补充维生素A和维生素C对营养缺乏所致免疫功能低下的影响.中国公共卫生，1998，14（12）：741-743.
6 杜卫东,沈道明,黄春锦，等. 大剂量维生素C对急性胰腺炎患者细胞免疫功能的影响.胃肠病学, 2002, 7（4）：213-215.
（编辑：守 中）
作者单位：100069 北京，首都医科大学免疫学系