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【摘要】 目的 探讨外源性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)抑制剂强力霉素在移植肺缺血-再灌注损伤中细胞凋亡的影响。 方法 建立大鼠自体左肺肺缺血再灌注模型，16只SD受体大鼠随机分为两组:缺血再灌注组和强力霉素组，用免疫组化方法观察移植肺Bcl-2、Bax和Caspase-3表达情况，并取肺组织平滑肌细胞进行培养，采用荧光技术测定肺组织细胞凋亡。结果 肺缺血再灌注后，与对照组相比，强力霉素组移植肺Bax和Caspase-3表达明显降低(P<0.01)，Bcl-2 的表达无明显变化(P>0.05)，但Bcl-2/Bax比例升高；荧光图片显示，强力霉素组的细胞凋亡明显较对照组减少。结论 强力霉素可能通过下调Bax、Caspase-3表达，提高Bcl-2/Bax比例而抑制肺缺血再灌注损伤的细胞凋亡，并通过降低基底膜的降解，减轻肺水肿，达到肺保护作用。
【关键词】 肺； 缺血-再灌注损伤； 强力霉素
Effect of doxycyline on pneumocyte apoptosis in ischemia-reperfusion injury of lung transplantation
SHU Sheng-qiang，LIN Hui-qing，HUANG Jie.
Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060，China
【Abstract】 Objective To investigate the effect of exogenous matrix metalloproteinase inhibitor on pneumocyte apoptosis in lung ischemia-reperfusion injury and the mechanism. Methods Models of ischemia-reperfusion lung injury in SD rats were randomly divided into two groups. The protein level expression of Bcl-2 、Bax and Caspase-3 was measured by immunohistochemistry methods after 2h transplantation. Apoptotic morphological changes were assayed with Hoechst 33258 staining and were observed under fluorescent microscope. Results The protein level expression of Bax and Caspase-3 was significantly decreased in doxycycline group than in control group (P<0.01)，the expression of Bcl-2 was not significantly increased in doxycycline group，but the ratio of Bcl-2/ Bax was significantly increased in doxycycline group (P<0.01). After treatment with MMPs inhibitor，PMVECs apoptosis decreased significant. Conclusions Doxycycline can suppress apoptosis and protect lung tissue cell in the lung ischemia-reperfusion injury.
【Key words】 lung； ischemia-reperfusion injury； doxycycline
肺移植作为治疗多种终末期肺疾病的有效方法，于1983年在临床上首次获得成功。但越来越多的证据显示，供肺/移植肺仍然易于受到保存损伤(缺血)和再灌注损伤，导致移植后早期严重移植肺功能不全的发生率高达20%，移植受者术后ICU监护时间延长，术后早期死亡率增加〖1〗，并与移植后晚期较高的闭塞性支气管炎（obliterative bronchitis，OB）发生率相关。因此，研究低温肺保存后再灌注损伤的机制，改善移植肺功能，仍然是肺移植领域中所急需解决的重点课题之一。众多研究表明，心肌细胞凋亡是肺缺血再灌注损伤的重要表现形式。细胞凋亡受多种因素的调控，尤其是凋亡调控基因Bcl-2、Bax和凋亡执行基因Caspase-3〖2，3〗。本研究旨在通过建立大鼠自体左肺肺缺血再灌注模型移植模型，探讨外源性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)抑制剂强力霉素在移植肺缺血-再灌注损伤中细胞凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 实验分组、模型建立和取样
1.1.1实验分组 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠16只(武汉大学医学院实验动物中心提供），体重250～340g，随机分为两组：A组（n=8）：缺血 （IR）组，大鼠左肺经历原位热缺血30min、冷缺血3h、热缺血30min和不同时间的再灌注处理；B 组（n=8）：治疗组，术前一次性灌胃，连续7天，缺血90min，再灌2h于左肺门开放前10min经颈静脉注入强力霉素30mg/(kg·d)，其余操作同IR组。A组和B组给予等体积的生理盐水。
1.1.2 大鼠自体左肺模拟原位移植模型的建立 术前30min肌注阿托品（0.5mg/kg），30g/L的戊巴比妥钠30mg/kg腹腔内注射，麻醉成功后，将大鼠右侧斜位固定于手术台上。气管切开插管连接微型动物呼吸机。辅助呼吸参数为：潮气量10ml/kg，呼吸频率75次/min，吸入氧浓度FiO21.0，呼气末正压2.0cmH2O。右侧颈动脉插管，用于采集标本、监测血压；右侧颈静脉穿刺备用；尾静脉微量注射泵持续补液，速度为4.0ml/(kg·h)。
经左第5肋间前外侧切口进胸并横断胸骨，打开纵隔。颈静脉注射肝素钠（375.0U/kg）后，剥离左肺门，离断左下肺韧带；经左向右游离右肺动脉、静脉及主支气管，预置阻断带。然后用一塑料袋（内径约2.5cm）套住左全肺，并在肺门处形成反折，连同塑料袋一起用无创伤钳于吸气末阻断左肺门根部〖1，2〗，此时潮气量减至8.0ml/kg，呼吸频率100次/min，其他参数不变。30min后，在反折的塑料袋加入冷生理盐水及小冰块，把套有塑料袋的左肺上提至切口平面（勿与周围脏器接触）。袋内置一温度计使之保持在4℃左右。冷缺血3h后去除冷盐水，使左肺又转变为热缺血;30min后松开无创伤钳，形成再灌注。同时颈静脉给予鱼精蛋白（2.4～3.0mg/kg）。待血压、呼吸稳定后（肉眼上，左肺变得红润，约需10min），夹闭右肺门，形成左单肺再灌注。
1.1.3 大鼠肺血管内皮细胞（PMVECs）的培养与鉴定 联合应用盐酸氯氨酮(20mg/kg)和安定(2mg/kg)麻醉，开胸在左心室剪一小口，从右心室注入20ml D-Hanks液(在1L去离子水中加入0.4gKCl，0.06g KH2PO4，8.0g NaCl，0.35g NaHCO3，0.08gNa2HPO4·12H2O，0.01g酚红调pH 7.2)灌注心脏，使肺脏充盈变白。D-Hanks液中漂洗肺脏后，在0.1%胰酶/0.1%EDTA中37℃消化15min，以除去上皮细胞，再以DMEM漂洗2次，小心剪取肺组织边缘约2～3mm的组织并剪成1mm×1mm×1.5mm的小块，加入1～2滴胎牛血清，接种到T25的培养瓶中，37℃CO2孵箱中放置30min，加入6ml含20%胎牛血清的DMEM培养液。
1.2 检测指标
1.2.1 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平变化 移植术后2h每组取移植肺，常规固定、脱水、包埋、切片，免疫组织化学染色检测Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平变化。采用SABC免疫组织化学方法。采用HMIAS-1000高清晰度彩色医学图文分析系统，进行图像灰度变换，使染色阳性面积与背景分开，并自动测量染色阳性面积。每张切片随机选5个视野，5个视野面积作为包容空间（或参考空间），将上述检测分子的阳性面积除以包容空间，取其均值（%）作为“阳性区域面积”。
1.2.2 细胞凋亡的荧光Hoechst33258染色 细胞凋亡的荧光Hoechst33258染色，用0.25%胰酶消化细胞，调整细胞数为4×105，离心弃上清液，细胞悬浮于100μl DMEM培养基后，加入20μl的0.5mg/ml Hoechst33258储存液，室温放置10min，荧光显微镜观察凋亡细胞并拍片。
1.3 统计学分析 所有数据均以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验。统计学处理由SPSS11.0统计软件完成。P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白水平变化 与对照组相比，强力霉素组Bax和Caspase-3表达明显降低(P<0.01)，Bcl-2表达无明显增高(P＞0.05)（表1）。
表1 各组Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达（略）
注:vs Con*P<0.01
2.2 细胞核形态的Hoechst 33258荧光染色 Hoechst 33258 是与 DNA 特异结合的蓝色荧光染料经荧光显微镜观察，经强力霉素对照组的细胞核呈现均匀的红色荧光，其细胞核边界规则整齐，染色质均匀分布(图 1)，对照组的PMVECs 细胞核则出现不均匀亮度的蓝色荧光，细胞核先后呈现凋亡早期(波纹状)、中期(核染色质凝聚，边缘化)和晚期(核裂解，产生凋亡小体)的典型变化，其凋亡的细胞主要是肺泡上皮细胞及内皮细胞(图2)。
3 讨论
缺血再灌注损伤是肺移植后早期出现原发性移植物功能不全（primary graft failure，PGF）的主要原因，临床主要表现为进行性的低氧血症，肺顺应性降低，毛细血管通透性增加导致肺水肿，在X线胸片上表现为广泛的肺泡密度增高影〖2〗。此外，IR可引发早期的排斥反应，并与移植后晚期较高的闭塞性支气管炎（OB）发生率相关〖4〗。因此开展移植肺IR损伤的研究对肺移植的成败显得尤为重要。
凋亡是以DNA发生特异性的片段化断裂，形态上表现为核固缩、胞膜内陷、皱缩、包裹胞质形成凋亡小体为特征，受特定的基因调控。Fischer及Stammberger等都曾提出凋亡为肺缺血再灌注损伤的早期事件〖5，6〗。虽然肺缺血再灌注损伤时产生的自由基、细胞因子等是促进细胞凋亡的诱导因素，但这些因素并不直接引起细胞凋亡，而是通过一定的信号传递方式激活生存与死亡的相关基因(如Bcl-2、Bax、p53等)，然后将信号传递到核内切酶，激活Caspase-3执行死亡功能。其中Bcl-2和Bax是两个重要的相关基因，前者抑制细胞凋亡，而后者促进细胞凋亡，并且Bcl-2和Bax蛋白表达的比例是决定细胞凋亡与否的关键〖7〗。
本实验也证明，再灌注后肺组织细胞凋亡明显增加，参与肺损伤作用。强力霉素能抑制在体肺缺血再灌注损伤中血管内皮细胞Bax和Caspase-3表达，对Bcl-2的表达无明显影响，但Bcl-2/Bax的比例明显提高，从而发挥抗肺血管内皮细胞凋亡的作用。
缺血-再灌注的损伤机制虽很复杂，但微血管完整性被破坏是其损伤的中心环节〖8〗。血管基底膜是控制微血管通透性的最重要的结构。外源性基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs ）是一类以Zn2+为辅助因子的蛋白酶家族，其中MMP-2和MMP-9能降解肺毛细血管基底膜的基质成分，与微血管完整性密切相关〖9〗。生理条件下，大鼠肺组织能表达低水平的proMMP-2及活性MMP-2、proMMP-9，几乎不表达活性MMP-9〖10〗。缺血、缺氧条件下能够诱发内皮细胞、血管平滑肌细胞等分泌MMPs；同时缺血-再灌注诱发炎症反应，此时，炎性细胞成为MMPs的重要来源。强力霉素是四环素类抗生素的一种，大量研究显示四环素类及它们经化学改良、非抗生素类似物是一类广谱的MMP抑制剂。其参与肺缺血再灌注损伤的可能机制表现在以下几个方面〖11〗：(1)抑制肺血管内皮细胞的凋亡；(2)通过清除其他细胞产生的反应性氯化物阻止MMP酶原的激活；(3)抑制其他胶原溶酶（如溶酶体酶、组织蛋白酶）；(4)减少中性粒细胞浸润至肺间质，抑制中性粒细胞脱颗粒。其机理有待进一步探讨。
综合本实验结果，缺血-再灌注肺损伤中，强力霉素通过抑制MMPs的分泌及激活，降低基底膜的降解，减轻肺水肿及炎症反应，抑制肺组织细胞凋亡，达到肺保护作用。
(本文图片见封三)（略）
【参考文献】
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(编辑：李 木)
作者单位： 430060 湖北武汉，武汉大学人民医院心血管内科