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【摘要】 目的 探讨氯化铈（CeCl3）诱导K562细胞凋亡的剂量效应关系。方法 采用荧光显微镜定性检测细胞凋亡；流式细胞术定量测定细胞凋亡率。结果 较低剂量情况下，氯化铈可以显著引起细胞凋亡，3mg/L尤为显著，其中加稀土后24h收获细胞的凋亡率显著高于加稀土48、72h后收获细胞的凋亡率。结论 氯化铈诱导K562细胞凋亡的作用不仅和稀土使用剂量有关，还与作用时间有关。
【关键词】 氯化铈； K562； 细胞凋亡
Study of cerium chloride induce K562 cell apoptosis
HAO Shu-xia， LU Hui-min, WANG Chun-yan, et al. Institute of Radiological Protection and Nuclear Safety, China CDC， Beijing 100088, China
【Abstract】 Objective To investigate dose-effect relation of cerium chloride induce K562 cell apoptosis. Methods Adopt fluorescence microscope and FCM detect the cell apoptosis. Results In the case of low-dose， cerium chlorid can arose cell apoptosis remarkably，especially 3mg/L and the 24 hour ’cell apoptosis ratio after adding cerium chloride is higher markedly the 48 and 72 hour’ cell apoptosis ratio.Conclusion The effect of cerium chloride induce the K562 cell apoptosis not only related its dosage but also the active time.
【Key words】 cerium chloride； K562； cell apoptosis
稀土放射性同位素早已广泛应用于肿瘤的诊断和治疗，国外从20世纪50年代就有稀土抗癌的报道［1］。我国从80年代中期开始在稀土抑癌作用及其作用机理方面开展了一些研究［2～5］。近年来，稀土诱导肿瘤细胞凋亡而达到抑癌作用的研究也时有报道［６］，但稀土诱导肿瘤细胞凋亡的剂量－效应关系的研究很少见报道，本研究重点对氯化铈诱导K562细胞凋亡及剂量－效应关系进行了初步探讨。通过研究进一步明确氯化铈诱导肿瘤细胞凋亡的作用及剂量效应关系，为今后稀土在抗肿瘤作用方面的深入研究提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料 (1)氯化铈购自中国有色金属研究院稀土应用中心，纯度>99.99％，将氯化铈溶液依次稀释成0、1、2、6、30、60、180、300、500、1000mg/L备用。(2)凋亡试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。
1.2 K562细胞体外培养 将K562细胞（由中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所放射毒理室提供）用含10% 胎牛血清的1640 培养基在 5% CO2、37℃、饱和湿度培养箱内常规培养。细胞培养至对数生长期时将细胞用1640 培养基配成浓度为3×105个/ml的单细胞悬液,接种1ml 于12孔板中，然后在各孔中再加入1ml各个浓度的氯化铈溶液，使细胞的终浓度为1.5×105个/ml，每个剂量设3个平行样，分别于上板后24、48、72h收获细胞。
1.3 实验方法
1.3.1 做流式细胞术检测细胞凋亡 将收获的K562细胞调整浓度至0.5～1×106/ml；取1ml细胞，1000rpm,4℃离心10min，弃上清；加入1ml冷的PBS轻轻振荡使细胞悬浮，1000rpm,4℃离心10min，弃上清；再用PBS洗一遍；将细胞重悬于200μl Binding Buffer，加入10μl FITC标记的Annexin-Ⅴ(20μg/ml),室温避光15min或4℃反应30min；再加入PI(50μg/ml)5μl,避光反应5min后,加入300μl Binding Buffer,立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1h)。
1.3.2 用荧光显微镜观察凋亡细胞 收集约106细胞，冷PBS洗2次，用Annexin-Ⅴ和PI染色，滴片后用荧光显微镜观察。
1.4 统计学方法 资料采用R×C列联表的χ2检验。
2 实验结果
2.1 稀土诱导K562细胞凋亡检测 见表1，图1、图2。从实验结果可见，不同剂量稀土施用后，24h收获细胞在3mg/L和90mg/L剂量组细胞凋亡率与阴性对照组比较差异有显著性；在48h收获细胞中，15mg/L、250mg/L和500mg/L剂量组比阴性对照组显著增高。表1 稀土对K562细胞凋亡率的影响 注：卡方检验，与对照组相比，P<0.05图2所示：其中Q1为死亡细胞，Q2为凋亡中晚期细胞和部分死细胞，Q3为活细胞， Q4为凋亡早期细胞。
2.2 荧光显微镜下观察细胞凋亡 见图3。图3所示：绿色单染细胞为早期凋亡细胞，红色单染细胞为死亡细胞，红绿双染细胞为凋亡中晚期细胞或死亡细胞。(本文图片见封三)
3 讨论
稀土元素的生物学效应谱广泛，剂量-反应关系复杂，本实验以K562细胞作为研究对象，观察了氯化铈诱导肿瘤细胞凋亡的作用，实验结果表明：氯化铈诱导K562细胞凋亡的作用不仅和稀土使用剂量有关，还与作用时间有关。从实验结果可以看出，3mg/L和90mg/L的氯化铈在施用后24h诱导细胞凋亡的作用最大，这与文献报道［4］的小剂量抑制肿瘤细胞增殖的作用相一致。对K562细胞作用48h的各个稀土剂量组，只有15mg/L、250mg/L和500mg/L三个剂量诱导K562细胞凋亡率显著高于阴性对照组；氯化铈作用K562细胞72h后，各个剂量均不能显著诱导肿瘤细胞凋亡，这进一步印证了不同剂量的稀土在不同的时间产生的作用不同［7］。在本实验中有些剂量还可以抑制肿瘤细胞凋亡，这可能与细胞对稀土的敏感性降低有关，但其确切的发生机理还需要深入研究。
稀土抑制肿瘤细胞增殖的文献已经有不少报道［4，8，9］，但氯化铈是如何诱导肿瘤细胞凋亡的文献却很少见报道，所以稀土诱导肿瘤细胞凋亡的发生机制还需要进一步的深入研究。
(注：基金来源：财政部专项工作经费)
【参考文献】
1 Anghileri L J. Antitumor or activity of gallium and lanthanum: role of cation-cell membrane interaction. Anticancer Research， 1987,7: 1205-1508.
2 彭少华，纪云晶，王宗惠，等. 混合硝酸稀土体内抗肿瘤作用的实验研究.卫生毒理学杂志，1994，8（3）：218-219.
3 肖白，纪云晶，崔明珍，等.镧铈对癌细胞恶性增殖抑制及相关基因表达的影响.中华预防医学杂志，1997，31（4）：228-230.
4 李晓滨，周爱儒，俞文华，等.稀土化合物氯化亚铈对人肺癌细胞PG、人胃癌细胞BCG-823的作用.中国生物化学与分子生物学报，1999，15（4）：651-654.
5 纪云晶，王宗惠，栗建林，等.轻稀土化合物抑瘤作用的研究.卫生研究，1995，24：10-15.
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7 聂毓秀.中国稀土学报，1990，8（4）：350.
8 李晓滨，周爱儒，俞文华，等.柠檬酸镧对人肺癌PG细胞、人胃癌BCG-823细胞的作用.中国稀土学报，2000，18（2）：156－159.
9 Hengstsch lager M.The role of p16 in the E2F-dependent thymidine kinase regulation. Oncogene, 1996, 12:1635-1643.
作者单位： 100088 北京，中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所
(编辑：守 中)