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【摘要】 以贻贝为原料制取降血压肽，探讨了不同酶解条件对其ACE抑制活性的影响，以及不同活性修饰方法对其降血压活性的影响。以SHR饲喂试验分析其降血压活性，利用小鼠急性经口毒性试验对其毒理进行了研究。结果表明，2＃降压肽降压效果较好，其在2～6h之内均有显著降压效果，平均降低为16～28mmHg。在6h处降压效果达到最大值为28mmHg。后经毒理试验表明其安全无毒。
【关键词】 贻贝； 酶解； 降血压肽；降压功能；毒理
Study on the antihypertensive function and toxicity of the enzymolyzed antihypertensive peptide extracted from aquatic product protein
WU Jin-chao，WANG Yi-fan，FANG Chang-fu.Second Institute of Oceanography，SOA，Hangzhou 310012，China
【Abstract】 To obtain enzymolyzed antihypertensive peptide from mytilus coruscus，this paper deals with the effect of different hydrolysis condition and modification on the ACE inhibitory activity and antihypertensive result. Using SHR-feeding experimentation to test its antihypertensive result and mice acute toxicity to evaluate its security. The results are as follows： antihypertensive peptide NO 2 has better result in 2 to 6 hours，the average reduced breadth is 16－28mmHg，and the peak point is after 6 hours. At last，the antihypertensive peptide is proved to be security by toxicity experimentation.
【Key words】 mytilus coruscus; enzymolysis； antihypertensive peptide；antihypertensive function; toxicity
据报道，我国目前有高血压患者一亿多人，每年将近一百万人因高血压而死亡［1］。目前高血压以药物治疗为主，但近来研究发现，人工合成降压药对患者靶器官有较大副作用且易引发咳嗽、浮肿等不适反应［2］。于是，人们转而研究从天然原料中制取具有降血压活性的降血压肽。降血压肽实质是一种血管紧张素转换酶抑制肽，它通过抑制血管紧张素转换酶（ACE），阻碍有升高血压作用的血管紧张素Ⅱ的生成，同时抑制具有降血压作用的血管舒缓激肽的分解，从而使血压下降，此即降血压肽的作用机理［3］。
近年来国际学术界对酶解降血压肽的研究较多，已报道有以牛奶、乳酪、大豆、鱼肉、蔬菜、小麦蛋白等食物为原料，经蛋白酶酶解产生了具有较好ACE抑制活性的酶解降血压肽［4～9］。Eiji等水解了12种食物蛋白进一步研究发现，短肽类（含2～4个氨基酸残基）比稍长肽链(含10～12个氨基酸残基)有更好的ACE抑制活性［8］。此外还发现，从鱼、贝、虾、蟹等水产动物蛋白中制得的酶解降血压肽其降压活性优于其他食物性蛋白［10］。
我国在酶解降血压肽领域的研究起步相对较晚，现有报道以大豆、蛇毒、老酒、茶叶为原料，对酶解降血压肽的制备工艺和活性基团等方面进行了一定研究［11～15］；对于最适合用于酶解降血压肽制备的水产动物蛋白的开发研究，则鲜有报道。
贻贝，又名海红、淡菜，近年来人工养殖取得重大成功，在我国东南沿海产量丰富。但由于加工手段和技术的落后，在收获季节产出的大量贻贝因得不到及时处理而造成极大浪费［16］。本研究以贻贝为原料，经酶解、活性修饰等方法制取降血压肽，然后利用SHR饲喂试验检测其降血压活性，并利用小鼠急性经口毒性试验检测其安全性，以期为水产蛋白酶解降血压肽的开发提供探索。
1 材料与方法
1.1 材料与设备 贻贝：市售。 ACE标准样品：Sigma试剂。 复合生物酶P1 (本项目组自行配制)，其组分均购自上海生物化学试剂公司。 降血压肽制备所需其他试剂，均为生化纯，上海生物化学试剂公司提供。 降压功能用动物：SHR（自发性高血压大鼠），上海高血压研究所提供。 安全性检测用动物：医学实验用ICR小鼠，浙江省疾病预防控制中心提供。
仪器设备：HPLC，大鼠血压仪（RBP-1B），中日友好医院提供；常用试验仪器若干。
1.2 实验步骤 根据本项目组前期研究经验和国际新近研究成果，结合有关蛋白酶酶解的作用特点，选取复合蛋白酶P1，在不同酶解条件下对贻贝蛋白进行酶解，采取Uniform Design(均匀设计)方案［17］，研究不同酶量、酶解时间、酶解温度、pH等四大因素下对ACE的抑制效果。选择最佳的酶解条件。
按上面实验所确定的酶解条件，取新鲜贻贝肉捣碎，酶解，纯化，然后加入不同活性修饰剂1＃，2＃进行活性修饰，提取，冷冻干燥，制备降血压肽1＃和2＃。
将制备的降血压肽样品分别进行降血压功能试验，分析其降血压效果。然后选取效果较好的一例进行安全性检测。
1.3 实验方法
1.3.1 酶解样品ACE抑制效果的分析 将贻贝洗净去壳，取肉末100g，加1.5倍水蒸煮10min，冷却，按均匀实验设计加入一定量的酶液，于特定温度、pH下酶解，搅拌，酶解完成后升温灭酶(95℃、10min)，再离心分离(4000rpm、10min)，取上清液定容至150ml待测。
用HPLC体外检测分析不同酶解条件下制备的酶解降血压肽对应的ACE抑制活性。有关步骤参照Cushman(1971)和后经Toshiro(1993)改进的方法进行［18，19］。将各酶解液反应值与空白样品对照，分析所得酶解降压肽的ACE抑制率。计算公式为：A─A (control) A×100%
1.3.2 降血压肽降压功能检测 测量方法：SHR血压测量，尾动脉法。每个样品动物试验，用5只4月龄SHR为一组。 将1＃和2＃样品分别以3.0g/kg体重的样品剂量进行灌胃。灌胃前和灌胃之后第2、4、6、8、10h分别检测血压一次，记录各血压值。
1.3.3 降血压肽的安全性检测 检测方法：小鼠急性经口毒性试验。
1.3.3.1 剂量和给染毒方式 样品设1.00、2.15、4.64和10.0 g/kg体重四个剂量组。每个剂量组10只动物，随机分组，雌雄各半。分别用1.00、2.15和4.64 g受试物加蒸馏水至10ml，采用一次经口灌胃方式，以0.1 ml/10 g体重计算染毒量，10.0g/kg体重组用10.0 g受试物加蒸馏水至20 ml，以0.2ml/10 g体重灌胃，染毒后继续禁食3h。
1.3.3.2 观察指标：染毒后，观察动物的一般状况、中毒表现和死亡情况，观察期限2周。按Horn’s法，求出半数致死量，并根据《食品安全性毒理学评价程序和方法》GB 15193～2003进行急性毒性分级。
2 结果
2.1 酶解条件对降血压肽ACE抑制率的影响 结果见表1。
2.2 不同活性修饰基团对降血压肽的降压效果的影响 结果见表2数据分析：采用各组分别服用降血压肽前后血压的变化情况来反映降压效果，数据以x±s表示，采用SPSS11.0 for windows 系统处理数据，并进行单因素方差分析，各组间进行Dunnett t多重比较。分析结果见表3。
2.3 降血压肽的安全性检测结果 见表4。表1 不同酶解条件对ACE抑制效果影响表2 降压肽样品降压效果表3 降血压肽降压效果多重比较结果表4 降血压肽对小鼠急性经口毒性试验结果
3 讨论与结论
3.1 P1酶最佳酶解条件 对于ACE抑制结果进行回归分析，所得回归方程为：
Y=70.464-1.195X1+15.299X2+11.971X3-4.310X22+0.194 X1X2-0.141X3X4根据方程分析最佳的ACE抑制活性为90.23%。但由实验结果在此条件下的实际ACE抑制率为86.55%，所以NO1为最佳条件。其ACE抑制率为88.08%，对应的最佳酶解条件为：酶量： 25IU/ml；酶解时间： 2h；pH 7.0；酶解温度： 60℃.
3.2 降血压肽的降压效果 由方差分析结果，查表得F0.05（2，9）＝4.26，可知对于处理4h和6h血压变化的F值＞F0.05（2，9），说明服用降压肽4h和6h效果有显著差异性（а＝0.05）。
同时，结果表明2＃降压肽在2～6h之内均有显著降压效果（а＝0.05），1＃在2h处有显著作用，同时2＃的降压效果优于1＃，平均降低为16～28mmHg。2#在6h处降压效果达到最大值为28mmHg，且效果极为显著（а＝0.01）。
根据国内外大量随机对照的临床试验结果，收缩压降低10～14mmHg和舒张压降低5～6mmHg，冠心病减少1/6，总的主要心血管事件减少1/3［20］，从这个意义上讲，贻贝酶解降压肽的降压效果非常显著，随着今后进一步研究，其有望作为一种高品质的食品、药品原料而大有用途。
3.3 降血压肽2＃的安全性检测结果 降血压肽2＃对雌雄两性小鼠经口LD50均大于10.0g/kg体重，根据急性毒性分级标准，其属于实际无毒类。
3.4 意义 经上述试验表明，以贻贝为原料可制备具有高降血压活性的降血压肽，且安全无毒。
作为世界第一水产大国，我国的水产品产量一直处于世界前列，但水产品深加工水平却相当落后，主要还停留在较低层次的产品加工，产品的附加值较低且市场前景有限。对于应用水产原料进行降血压肽的开发研究工作还比较落后。鉴于以上情况，加大从水产蛋白中研制开发具有较高降血压活性的酶解降血压肽，则对于缓解以上问题有较为积极的意义。
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作者单位： 310012 浙江杭州，国家海洋局第二海洋研究所
(编辑：守 中)