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【摘要】 目的 观察战创伤引起的关节缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion，IR）过程中滑膜及软骨形态、结构和功能变化，为明确IR的机制及防止方法提供依据。方法 在建立肢体缺血再灌注模型的基础上，利用中药进行干预，并观察滑膜及软骨组织形态、代谢及功能变化。结果 IR初期，关节滑膜及软骨组织中丙二醛（MDA）、乳酸、多型核白细胞（PMN）明显增高，而超氧化物歧化酶（SOD）及软骨中Ⅱ型胶原降低；应用中药治疗组上述指标差异具有统计学意义（P＜0.05），而且修复时间明显缩短，功能明显改善。结论 IR确可致关节滑膜及软骨损伤，且是发生继发创伤性关节炎的重要因素。应用自制的中药消灵仙后可减轻病理生理变化、组织病理改变，减轻关节病损，改善关节功能。
【关键词】 缺血再灌注损伤；滑膜；软骨；黄芪；红花
The effects of Chinese medicine xiaolingxian ointment on the ischemia-reperfusion injury in rabbits knee
WANG Cheng-qi，WANG Jian-li，SUN Xin-jun，et al.The 89th Hospital of PLA，The Institute of Orthopaedic Trauma of PLA，Weifang，Shandong 261021，China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of Chinese medicine xiaolingxian ointment on the ischemia-reperfusion in rabbits knee and offer experimental proofs to prevent or to treat the dysfunction of the joints after replantation in digital or limb amputation clinically.Methods 50 New Zealand health white rabbits，eithe male or female，weighting （2.88±0.38）kg，were randomized into two groups，ischemia reperfusion group（A），xiaolingxian ointment group（B）. 25 rabbits were devided into five sub-groups randomly in each group. Rabbits were sacrificed at 1、2、4、8and 12 weeks after ischemia-reperfusion. Synovia and synovial membrane were gathered to be measured by lactic acid、SOD、MDA、NOS and observed by light microscope、electron microscope and immunochemical method.Results The surface of synovium was destructed accompanied with degeneration and necrosis of the synoviocytes. In group B，the injury were gently. Between 8 weeks and 12 weeks，the surface of synovium was repaired with the hyperplasia of synovicytes and excessive fibrosis in group A. In group B，the synovium were normal with more capillary vessel than that in group A.The changes of MDA and lactic acid were parallel in four groups. It gradually decreased from 1 to 12 weeks after IR injury. However，at the same time points，Compared with group A，MDA was significantly lower in group B （P＜0.05）. On the contrary，the activity of SOD and NOS were increased gradually from 1 to 12 weeks after IR injury in four groups. SOD and NOS in group A were significantly lower in group A than that in group B（P＜0，05）. At 4～12 weeks，the amount of activity in knee in group A was significantly lower than that in group B（P＜0.05）.Conclusion （1）Chinese medicine xiaolingxian can alleviate the ischemia reperfusion injury of the joints by relieve lipid peroxidation，reinforcing antioxidant enzyme.（2）Chinese medicine xiaolingxian can facilitate blood capillary regeneration，maintain microcirculation.
【Key words】 ischemia reperfusion injury;synovium;cartilage;mongolian milkvetch root;safflower
战创伤致膝关节病废是为常见，尤其是血管损伤、挤压伤、止血带应用不当及休克时间过长等，肢体恢复血运后常出现膝关节各种组织的再灌注损伤，从而导致膝关节一系列病变，严重影响膝关节功能。为此，我们建立实验动物模型，并观察关节滑膜、软骨等组织形态、代谢及功能变化。同时对自制中药消灵仙的作用进行了实验研究和效果评价。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 MDA、SOD、乳酸测试试剂盒（南京建成生物工程研究所），Ⅷ因子免疫组化试剂盒（Santa Cruz公司），DAB显色试剂盒（北京中山），PBS缓冲液（武汉博士德）。
1.2 主要方法
1.2.1 IR模型的制作 采用改良的夹闭血管的方法［1］。
1.2.2 中药消灵仙软膏的配方及制备 （1）配方：黄芪、红花、三七、透骨草、伸筋草、当归、威灵仙、紫苏、骨碎补、川牛膝等十几味中草药，经特殊加工配制而成。（2）配制：有两种方剂：一种是配制成注射的针剂关节腔内注射；另一种是配制成药膏关节部位涂敷。将药物研磨粉碎后浸入麻油内，文火熬至药枯浮起为度，停火10min，滤去药渣，取油液称重，按每斤油液加黄丹500g，搅至黑亮如镜，滴水成珠为度。用时涂软膏于裱褙材料上，直接敷于膝部。
1.3 实验动物及分组 取健康成年新西兰大耳白兔50只，随机分两组：单纯缺血再灌注组（A），中药消灵仙关节腔内注射和软膏涂敷治疗组（B），每组25只，分为5个时间点，每个时间点5只。
1.4 药物干预方法 实验动物肢体缺血时间均为8h。缺血后再灌注时间分别为1周、2周、4周、8周、12周。A组除肌注青霉素外，未加任何处理因素；B组术后即刻给涂敷消灵仙软膏于膝关节，3天换药1次，换药前洗净原药膏，共4周。其余同A组；关节腔内注射组亦分别进行。
1.5 取材及标本制备 分别于术后1周、2周、4周、8周、12周活杀动物，切开膝关节囊，先用注射器吸取关节滑液，然后切取滑膜组织及股骨外髁负重区软骨，将上述标本立即置于-20℃冰箱中备用。
1.5.1 组织匀浆的制备 取重约0.2g的滑膜组织，用冷生理盐水漂洗后，除去杂质，滤纸吸干，电子天平称量，按1：9（重量：体积）加入匀浆介质，置水浴中剪碎，用匀浆仪匀浆。时间10s/次，间隔30s，连续3～5次至细胞破碎，制成10%的组织匀浆。将匀浆液以3000r/min，离心15min，取上清液，保存于-20℃的冰箱中待测。
1.5.2 光、电镜标本制作 滑膜组织、关节软骨用冷生理盐水漂洗后，用锐刀切成长约4mm的薄组织块，浸入4%的多聚甲醛溶液中固定。常规脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色，光学显微镜下观察、拍照。用预冷的锐刀切取1mm3大小的滑膜组织，置于预冷的2%戊二醛溶液中固定2h，取出于4℃下用PBS溶液反复漂洗2～3h，以1%锇酸固定2h，4℃酒精梯度脱水，浸蜡、包埋，制成超薄切片，用H7500型透射电子显微镜观察、拍照。
1.6 检测指标 关节滑液中乳酸含量；滑膜匀浆液中MDA、SOD的测定（分光光度法）；滑膜组织中毛细血管数、MMP及关节软骨中Ⅱ型胶原变化（免疫组化染色）；术后12周关节被动活动度测定。
1.7 统计学分析 所有计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS统计软件，组间差别采用方差分析。P＜0.05表示差异有显著性；P＜0.01表示差异有非常显著性。
2 结果
2.1 大体观察 对照组术后2周内，膝关节均有不同程度的肿胀，而中药治疗组1周后肿胀明显减轻；2周后可见动物术侧肢体活动范围治疗组较对照组有不同程度的增大（详见关节活动度测定）。2周内取材时，见对照组关节腔内滑液浑浊（80%），60%有血性渗出；滑液量术后12周时仍少于0.1ml，而中药治疗组滑液量在治疗2周后均在0.2ml以上，蛋清样透明。
IR后2周内，滑膜组织可见不同程度的充血、肿胀，以对照组为重。8～12周时，治疗组滑膜基本正常，对照组部分动物出现滑膜增生。
2.2 组织学观察
2.2.1 关节滑膜及软骨光镜观察 （1）关节滑膜光镜观察：对照组IR损伤后1周，关节滑膜内血管扩张，伴有毛细血管充血；细胞间质明显水肿，表层滑膜细胞有坏死脱落，间质散在数量不等的炎性细胞；IR后2周时，滑膜间质中度水肿，间质内大量炎性细胞浸润，呈肉芽样变；IR 4周，坏死的滑膜组织内可见大量的成纤维细胞，表层滑膜细胞向脱落处延伸生长。滑膜下层血管较1周时多；8～12周，滑膜组织纤维增生，血管明显减少，间质偶见炎性细胞浸润。消灵仙治疗组，IR后1～2周，滑膜间质轻度水肿，未见毛细血管充血及EC损伤，有少量炎性细胞浸润，未见表层滑膜细胞坏死、脱落；2周时，见滑膜间质少量的多形核细胞浸润，有少量新生血管；8～12周，滑膜间质中毛细血管数无明显减少，可见滑膜细胞层次排列清晰，未出现间质胶原纤维增生。（2）关节软骨光镜观察：对照组IR损伤1～2周，各组软骨细胞变化不大，仅有软骨细胞轻度肿胀；IR 4周，可见软骨表面粗糙，局灶性细胞变性、坏死脱落；12周时，可见细胞层次减少，分辨不清，部分关节软骨被纤维化骨所取代。治疗组药物治疗后2周，关节软骨未见异常改变；4周时，未见细胞坏死脱落；8周时，关节软骨表面无凹陷，细胞层次清晰，各层排列较规则；12周时，可见软骨表面光滑，细胞排列整齐。
2.2.2 关节滑膜电镜观察 对照组IR损伤1周，可见血管内皮细胞连接消失，胞膜出现髓鞘样变，线粒体肿胀破坏，核染色质边集、消失等；滑膜细胞，胞浆内粗面内质网和多聚核糖体减少、消失，线粒体空泡样变，核染色质固缩、边集。IR后12周，A组毛细血管EC仍肿胀，管腔狭窄，部分血管闭塞；滑膜细胞胞浆内有空泡，线粒体肿胀，粗面内质网和多聚核糖体较1周时增多。应用消灵仙治疗组，治疗后1～2周时，血管内皮细胞肿胀，但未见胞膜髓鞘样变；线粒体空泡样变，嵴突变短，核染色质边集等；滑膜细胞形状不规则，胞浆电子密度降低，核周间隙局部明显增宽，核染色质浓密，多数在核周缘，线粒体空泡样变。IR后8～12周，治疗组，毛细血管EC结构清晰、完整，胞浆内可见吞饮小泡、核糖体和发达的高尔基复合体；毛细血管管腔内有红细胞通过。 关节软骨电镜观察：对照组单纯IR 损伤12周，软骨细胞核固缩，核周缘明显增宽，核膜模糊，大量粗面内质网扩张，网腔内有中等电子密度的物质，线粒体空泡样变。应用中药消仙灵软膏12周，软骨细胞有大小不等的突起，胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体；核染色质疏松，成颗粒状或小块状。
2.3 滑膜代谢及功能变化
2.3.1 关节滑液中乳酸的变化 对照组滑液中乳酸含量在各时间点均高于治疗组，至IR 12周时仍大于正常值（18.6±4.3）nmol/L。见表1。
2.3.2 滑膜组织中MDA的变化 滑膜中MDA在对照组及治疗组，其含量随术后时间延长逐渐下降，其幅度以B组为快。术后12周，MDA变化见表2，且在同一组内MDA在2周内显著高于4～12周。
2.3.3 滑膜组织中SOD的变化 滑膜组织中SOD的变化与MDA相反，术后1～12周呈逐渐升高的趋势，术后8～12周显著高于术后1～4周（P＜0.05），见表3表1 IR不同组别关节滑液中乳酸的变化注：与对照组比较，差异有显著性，aP＜0.05表2 IR后不同处理组MDA含量的变化 注：与对照组比较，aP＜0.05表3 IR后不同处理组SOD含量的变化注：与对照组比较，aP＜0.05
2.3.4 滑膜组织中毛细血管的变化 与正常滑膜组织比较，IR损伤1周，对照组可见细小血管数明显减少，而给予治疗的B组血管数减少的程度较A组轻；2周时，各组动物滑膜组织中有数目不等的新生血管。IR 后8周，对照组滑膜组织中毛细血管数随着组织的纤维化明显减少，而治疗组血管数有不同程度的增加（表4）。表4 IR后不同组别滑膜中血管数变化（个/200倍的视野）注：同一时间点，对照组显著降低，P＜0.05
2.3.5 关节软骨中Ⅱ型胶原及MMP变化 IR后1天，软骨基质中MMP-3有所减少，IR后3天，其表达显著增多，1～2周达峰值，之后逐渐回落，药物治疗组峰值较对照组低，4周后与正常组织中差异无统计学意义。IR后软骨基质中型胶原表达减少，且分布不均；药物治疗组4周时趋于正常，而对照组8周时仍较正常组织中低。
2.4 关节活动度的变化 正常兔膝关节被动活动度为屈曲60°，后伸40°～45°，术前测40只兔左膝关节活动范围，平均值104°±7.3°，作为正常对照。IR后最初2周，各组动物实验侧关节主动活动度明显减少；治疗组，4周时活动度较2周时有所增加，IR后8～12周，双侧肢体均参与活动及负重。对照组IR后4～12周，被动活动度逐渐降低。关节被动活动度变化见表5。表5 IR后4～12周关节活动度变化（屈曲90°中立位，被动活动）注：与正常膝关节比较，差异有显著性，*P＜0.05
3 讨论
随着创战伤外科的复杂程度不断增加，四肢血管损伤也随之增加，从而导致关节缺血再灌注伤亦为常见。断肢（指）再植成活率高达95%，但再植肢体术后功能恢复仍不能令人满意［2］。如肢（指）体怕凉、疼痛、患指缩小、关节粘连、强直、僵硬，甚至关节畸形、继发创伤性关节炎等，这一直困扰着外科工作者如何提高功能的恢复。
在肢体缺血再灌注损伤的研究中，目前主要集中在对关节外组织，如皮肤、血管、骨骼肌、肌腱及周围神经等，但对关节本身缺血再灌注损伤的研究，目前国内外却较少报道。我们的前期研究显示：肢体的缺血再灌注损伤可以造成明显的关节滑膜破坏［3］。IR早期（2周），原发性再灌注损伤是构成滑膜组织损伤的基础，PMN在呼吸爆发中产生的大量自由基进一步加重了滑膜组织的继发性损伤；严重的组织破坏及粒细胞浸润变成慢性滑膜炎，改变了滑膜细胞的功能，再加上血运障碍长期得不到纠正，代谢废物的局部聚集，加重了关节面的破坏，导致和促进了创伤性关节炎的发生发展［4］。
近年的研究表明，中药黄芪、红花、三七等，其有效成分如黄酮、红花黄色素等可减轻组织器官的再灌注损伤［5～7］，改善受累组织的微循环灌注，本研究依据我们多年外用中药的经验，提取其有效成分组成复方。实验结果表明：药物应用后早期可明显减缓组织缺血后的再灌注损伤，这与其他脏器IR损伤的治疗作用类似［7，8］。其一是通过黄酮及红花黄色素等有效成分对O2 · -及OH－自由基的清除，从而避免细胞膜的脂质过氧化损伤及酶类的氧化失活，维持细胞的能量代谢［6］。其二，与黄芪恢复SOD活性，有效消除自由基，阻止或减轻自由基导致的细胞损伤，保护细胞膜、线粒体和溶酶体，增强抗缺氧能力，保护细胞有关［5］。此外，可能与其中的三七总皂苷对多形核白细胞呼吸爆发时产生的氧自由基及黄嘌呤氧化酶体系产生的O2 · -均具有清除作用有关［9］。
本实验结果显示IR后期（4～12周），药物治疗组微循环得到明显的改善，毛细血管数及通血率明显提高，滑液中乳酸含量显著降低。在组织学方面，消灵仙治疗可以减轻毛细血管EC的损伤及间质的水肿程度；IR 2周后，对促进毛细血管的形成、维持毛细血管的数量和通血都有较好的作用，对再灌注后关节滑膜及软骨具有保护作用，避免继发创伤性关节炎的发生和发展。
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作者单位： 261021 山东潍坊，解放军第89医院全军创伤骨科研究所
（编辑：悦 铭）