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脊髓损伤后缺损部位的桥接一直是现代SCI实验研究的主要原则，而连接缺损两端的物质基础无外乎组织、细胞或人工仿生材料。但由于脊髓解剖结构的复杂性，外源性组织的简单连接目前仅能提供促轴突再生的支架结构，或有限的神经营养作用；对神经元的再生和保护则难以通过单纯的细胞和组织移植来达到。有鉴于此，人们通过基因修饰，干细胞移植等技术以图尽可能的恢复受损部位的细胞结构和轴突排列。
1 中枢神经（CNS）
组织移植应用移植技术治疗SCI近年发展很快，SCI后再生困难大多因为损伤局部组织学混乱，缺乏支持及引导神经细胞再分布及神经轴定再生及延伸的组织细胞学基础，尤其是某些损伤后残留的细胞分解成分（如髓鞘分解产物等）能特异性的阻碍轴突再生。由于支持细胞、神经营养因子、细胞外基质的缺乏，加上损伤后继发的胶质细胞增生所致的机械屏障，使得如何改善SCI局部微环境成为人们关注的焦点。通常外源性补充的神经组织包括胚胎组织、胚胎源性细胞悬液及多类神经细胞混合物，神经组织块移植很早就被尝试。
1.1 胚胎组织的移植研究 胚胎组织移植大体可分为胚胎细胞移植及胚胎组织块移植。基于现代实验技术及各类细胞分选（如流式、免疫磁珠）技术的完善，人类已能通过CD表面抗原的识别，在细胞亚型水平分选细胞，以有选择的作特异细胞类型的移植。细胞移植经历过粗制细胞悬液直接移植及纯化细胞移植两个阶段，早期的研究通过胚胎组织的提取，细胞悬液的制备及多种细胞混合液的直接输注，来达到实验修复SCI的目的，取得一定实际效果，但对从分子水平及修复期细胞间相互作用的机制的研究于事无补。 目前的研究集中在搞清SCI局部细胞间相互作用于神经修复的意义，故各类神经前体及神经干细胞在SCI中的修复意义，分阶段的由单种类细胞移植到多种类细胞联合移植，是人们了解SCI修复的必经之路。
1.2 胚胎脊髓神经细胞悬液（FSCS）移植 FSCS移植后如细胞膜完整，具备细胞黏附分子（CAM）蛋白，细胞核仁粗大，染色体由颗粒状变为纤维状，各种细胞器发育良好，说明细胞存活，随移植时间延长，成神经细胞与胶质细胞逐渐成熟。FSCS不仅发挥胚胎细胞期干细胞的能力，而且释放诸多NTF。神经细胞与胶质细胞功能活跃，细胞间出现复杂的连接，与此同时，还出现多种形式结构完善的突触，有髓、无髓神经纤维与胶质纤维形成的网络以及血脑屏障等。
2 雪旺氏细胞（Schwann cells，Sc）
移植 Sc对于周围神经（PN）损伤后再生具有特殊意义，近二十余年的实验研究发现对于CNS损伤，Sc损伤同样具有一定的促神经元修复，促轴突再生，使脱髓鞘轴突髓鞘化等重要修复功能：有关Sc诱导CNS再生能力的机制，归纳有：（1）Sc可合成，分泌各类NTF，如N营养因子（NGF），脑源性神经营养因子（BDNF），睫状神经营养因子（CNTF），胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等；（2）Sc可在其表面表达细胞黏附分子（如NCAM和L1）；（3）SＣＳ可为轴突释放趋向分子；（4）产生细胞外基质（ECM），如胶原、髓磷脂相关糖蛋白（MAG）。SCS的移植方式多种：（1）单纯细胞悬液移植：首先调整适宜细胞浓度，采用微量移液管刺入靶区后，边缓慢拔出，边持续注入高纯度SCS悬液。（2）有学者采用组织工程法构造SCS与多种人工材料复合物。（3）雪旺细胞与其他N细胞的联合移植，由于SCS具有以上各种有利SCI恢复的生物学优势，人们自然地联想到将之与其他N元、NSC或胚胎脊髓细胞等共同植入。最近的研究热点将骨髓基质于细胞（MSC）与SCS的联合移植应用于SCI，具有代表意义的是Paino（1994）从E16大鼠取出DRG纯化出SCS另自E15大鼠DRG中进行N元纯化培养，分离的N元平铺在干燥的胶原上，至第3周可见N元胞体之间平行排列众多轴突，然后在其上种植SCS，经6周共同培养，SCS增殖于所有轴突之间，后者覆被有丰富的髓鞘。
3 嗅觉胶质细胞(olfactory enshealth glial，OEG)
移植治疗脊髓损伤 嗅黏膜内的神经元是人体内惟一的在出生后形成并在整个成年时期保持分化的神经元细胞。轴突之所以能从嗅黏膜长入嗅球有赖于一种特殊分化的胶质细胞（嗅觉成鞘细胞）的帮助。这些嗅觉成鞘细胞同时具有雪旺细胞和星形胶质细胞的特点。雪旺细胞只在外周神经生长中起作用，而嗅觉成鞘细胞却可以伴随嗅觉轴突进入CNS。多数学者相信，嗅觉成鞘细胞提供了轴突长入嗅球相应位点所需的向导作用。目前为止，嗅觉成鞘细胞是所知的惟一能穿过外周神经与中枢神经边界的胶质细胞，而且实验证明它们能使培养的神经轴突适当地髓鞘化。Li等从成年大鼠的嗅球取得成鞘细胞进行培养，发现它们促使成年大鼠损伤的皮质脊髓通路出现不分支的再生性生长，这些再生的轴突长过病灶并进入远端神经通路。已经证实嗅觉细胞不但能使单个轴突髓鞘化也能围绕一组轴突而形成神经束。人自体嗅黏膜细胞培养获得成功，从而克服了免疫排斥和免疫抑制的困难。 与SCS相比 OEGS兼有SCS和星形胶质细胞的特点。不同于SCS只局限在外周系统，OEGS可伴随嗅束进入中枢神经系统。植入培养的OEGS能改善脊髓轴索的生长，使之通过脊髓损伤部位而重新进入中枢神经系统。OEGS是一种仅位于嗅神经和嗅球第一、二层的大胶质细胞，可以终生产生维持神经元存活和轴索延长的神经营养因子和神经突促进因子；在神经轴突发育和再生时，包裹轴突并随延长的轴突一同迁移。OEGS的这一特性是用它来促进脊髓轴索再生的理论基础。
4 胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）和神经干细胞（Neural stem cell，NSC）
移植胚胎干细胞在一定条件下可分化为神经元和支持细胞（如星形细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞等），分泌某些生物活性物质，促进脊髓组织再生，恢复脊髓功能。Liu等将胚胎干细胞植入脱髓鞘的成年大鼠脊髓脊柱中，3天后脱髓鞘处ESC存活，分化为成熟的少突胶质细胞，诱导轴突髓鞘形成。Whittemore等使用有丝分裂促进剂扩增人胚胎脊髓细胞，获得未分化神经前体细胞群后，在表皮生长因子和纤维母细胞生长因子存在下扩增、传代，发现其分化为神经元和星形细胞的多能性至少可保持4代，然后将其植入脊髓受损区，可恢复脊髓损伤区的部分解剖连续性。神经干细胞是一种能产生神经元和胶质细胞的前体细胞，其可由胚胎和成年哺乳动物中枢神经组织分离而得，Martiney－serrano等报道了将神经干细胞作为细胞系培养转导后，移植到受损区，移植细胞存活、整合、分化为神经元和胶质细胞，阻断了神经元变性，促进了脊髓功能恢复。Liu等利用逆转录病毒载体将NT-3基因成功转入神经干细胞后，移植到免疫抑制后的成年大鼠脊髓，结果表明：移植细胞存活2个月以上，并分化成神经元和胶质细胞，同时自移植处向远方迁移。
5 实验性SCI基因治疗
基因转移主要采用ex vivo，即体外修饰法，即先在体外对适宜的受体C进行遗传修饰，使其具备表达特定重组蛋白的能力，然后将工程细胞移植到SCI部位，达到N营养因子/N递质或其他有利SCI修复因子表达的目的；最好能运用载体上的基因调控序列，有效的控制目的片段的表达。受体细胞可源于自身，经体外纯化，筛选高表达的细胞克隆后，应用立体定位或影像导引技术将工程细胞准确移植到CNS靶位。而在体基因转移（in vivo）法是利用靶区特异性病毒载体或非特异性的脂质体载体，直接完成治疗基因的局部投递。鉴于目的基因直接转移的效率较低，表达范围及表达效率的可控性差，故较少采用。
5.1 SCI基因治疗的分子生物学基础
5.1.1 载体的选择 载体即能携带外源基因进入靶细胞，并使外源基因得以扩增的运载分子，目前研究较为成熟的载体大体分为两大类，一大类为病毒载体，按照应用及掌握的程度包括腺病毒载体(adnovirus vector，Adv)、逆转录病毒载体(retrotranscript virus vector，Rv)、腺相关病毒（AAV）、单纯疱疹病毒（HSV）、HIV、慢病毒（lentivirus）；另一类则为非病毒载体，包括阳离子脂质体，受体介导蛋白（RMP）。
5.1.2 重组体的构建 重组体系指采用基因工程原理，将外源目的片段DNA（如神经营养因子基因），与带有相应启动子/增强子，或表达调控序列的载体接合为基因重组分子。其中的目的基因片段的获取来源广泛，可通过基因组DNA、cDNA文库的PCR方法及mRNA逆转录，甚至基因序列的全人工合成来得到。载体与目的片段连接技术包括平末端、粘端、人工接头等方法连接在一起。
5.1.3 基因标记 采用基因标记的目的在于明确：(1)外源基因能否顺利实现在靶细胞或靶区组织内的克隆；(2)能检测移植后工程细胞目的基因的表达的时序特性，并有可能作出定量分析。常用的基因标记有GFP（绿色荧光蛋白）、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因等。由于GFP检测灵敏度高，可与目蹬基因产物构成融合蛋白，无细胞毒性等而在神经科学领域备受青睐。
5.1.4 受体细胞的选择 作为目的基因表达的反应场所，受体细胞是外源基因获得增殖、表达的生物工厂。因此它必须满足：(1)易于获取并具增殖优势；(2)能耐受外源基因分子的侵入，并易于接受转化；(3)易于移植，存活能力强，且能长期表达外源基因；(4)无免疫源性和肿瘤形成的危险。现阶段应用于SCI的受体细胞有：成纤维细胞、Sc细胞、NSc、神经胶质细胞，以Sc细胞及成纤维细胞应用较多，由于NSc众所周知的优势，其作为基因工程受体细胞的研究正如火如荼，而目前又出现嗅鞘胶质细胞（OEG）。
5.2 外源基因的局部投递 目前常用的技术路线是以腺病毒、逆转录病毒为载体，将外源基因与之重组构成真核表达载体，然后再转染受体细胞，最后引入SCI部位，使之在损伤局部产生具有治疗作用的高浓度营养因子。基因的引入包括质粒或病毒的直接局部注射，体外细胞遗传修饰回输（ex vivo）。由于直接局部注射的可控性、稳定性差，故后者是目前基因治疗的主要手段。
5.2.1 神经营养因子（NF）基因 神经营养因子对脊髓损伤治疗的实验研究是人们对SCI探索的经典领域，从最初NTF的直接投放到损伤局部，到目前的重组基因及基因修饰治疗。由于NTF存在半衰期短，活性易受外界影响，尤其异种蛋白还具有免疫源性，这些都限制了NTF的直接使用。基因工程技术的兴起使人们想到了转基因技术，由此而产生了一系列各种NTF与基因载体、细胞载体的组合。 而近年随着更多载体细胞的出现，人们尝试将NTF转至SC细胞、神经干细胞、嗅鞘胶质细胞（OEG），不仅发挥NTF固有的神经营养效应，亦利用这些载体细胞本身优势达到理想的修复效果。Timothy Himes等（2001）构建出编码人NT-3，NGF的腺病毒载体，将之体外转染至神经干细胞株C17.2，得到可分泌NT-3、NGF的工程细胞。在T7-8 半切的脊髓损伤部位移植后2个月，NT-3移植组较NGF组神经元丢失更少，表现出近似于胚胎神经组织移植的神经元保护效果。Jackson9（2002） 首次报道以嗅鞘胶质细胞作为基因转染载体，在其构建有神经营养因子基因的腺病毒和慢病毒（lentivirus，LV）的对比研究中发现：LV载体的转基因表达可持续至少4个月之久。而腺病毒介导的转基因表达在移植后7～30天内逐渐下降。
5.2.2 其他相关细胞因子基因 影响SCI局部再生微环境的细胞因子错综复杂，修复机制除了维持局部高浓度的营养因子外，还应关注有利再生的其他途径。Falchetti(2002)为改变SCI后局部缺血缺氧，缺乏NTF的状况，将编码VEGF165(血管生长因子)的腺病毒溶液与matrigel（膜蛋白抽提物）的混合物置于T8横断处，损伤后3～10天发现损伤部位大量血管增生，还有少量皮质脊髓束穿过损伤区，体现了促血管、促神经再生的双重效应。 抗细胞凋亡机制也被引入SCI修复领域，Yukawa 用编码抗凋亡基因Bcl-2的腺病毒溶液，直接注射于重锤坠击脊髓伤的大鼠损伤脊髓处，在编码报告基因β－gal腺病毒的对照下，前者能有效的挽救神经细胞的凋亡，该实验同时强调了SCI后早期干预的重要性。
6 中枢神经组织工程
组织工程技术在神经科学的应用最早始于周围神经损伤的治疗研究，种子细胞以雪旺细胞为主，人工材料多采用PLGA等生物可降解吸收高分子物质；而脊髓损伤的组织工程研究则是近年的研究方向。由于脊髓等中枢神经结构的高度复杂、有序性，目前的工作主要还处在初期的细胞移植阶段。 近十年干细胞、尤其是神经干细胞的研究，使之成为中枢神经损伤组织工程修复的重要种子细胞，而经过基因修饰的，尤其是转染有NTF的神经干细胞正在成为种子细胞的热点。Vacanti、leonard（2001）等在大鼠脊髓Ｔ9处切掉3～4ｍｍ脊髓，造成脊髓横断。把成年大鼠脊髓神经干细胞在体外扩增培养，并以绿荧光蛋白标记后种到多聚羟基乙酸滤网上，移植到损伤部位，再用羟甲基纤维素膜覆盖，对照组单纯移植细胞或羟甲基纤维素膜。根据ＢＢＢ评分评估感觉和运动功能，并进行形态学观察。形态学结果表明对照组无新生组织，而种植细胞滤网组有新组织生成，直径约为邻近脊髓的70%，但无有序结构。含有纺锤状细胞，可能是神经元。脊髓原有的板层结构消失，有大量的ＧＦＡＰ阳性细胞。2周后的组织化学显示，ＧＦＰ阳性的细胞也呈ＮＦ、ＧＦＡＰ和ＭＢＰ阳性，未见ＧＦＰ和ｎｅｓｔｉｎ同时显阳性的细胞，说明移植的神经干细胞已全部分化。在功能评估实验中，对照组动物后肢的感觉和运动功能没有明显改善，种植细胞滤网组动物在手术4周后肢功能有明显改善，步态参数接近正常。感觉功能也有显著改善。本实验采用合成的、具有生物相容性和体内可降解的支架，明显改善脊髓横断的动物后肢功能，结果显示越过横断面的神经回路可以实现功能重建，提供了一个可以应用于临床的脊髓损伤修复模型。 综上所述，对于脊髓损伤修复的实验研究目前还处于细胞水平，而功能及结构恢复研究的每前进一小步，势必需要脊髓损伤分子机制阐明的一大步！随着轴突导向识别机制、神经干细胞分化调控机制及材料科学的相关进展，脊髓损伤修复的实验研究一定会取得更大的进步!
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作者单位：518035 广东深圳，南方医科大学附属深圳第二人民医院脊柱外科
(编辑：守 中)