早期给予黄芪注射液治疗大鼠脑出血对血肿周围胞凋亡的影响

     早期给予黄芪注射液治疗大鼠脑出血对血肿周围胞凋亡的影响 (pdf)  

   【摘要】 目的 探讨大鼠实验性脑出血后早期给予黄芪注射液对血肿周围细胞凋亡及细胞凋亡因子Caspase-3的影响。方法 将脑出血模型大鼠随机分成4个治疗组（手术同时治疗组、术后6h治疗组、术后12h治疗组、术后24h治疗组）和1个出血对照组。各治疗组每日给予腹腔注射黄芪注射液1次。然后各组分别于不同时期处死，取脑，连续切片作TUNEL染色和Caspase-3免疫组化染色。观察不同时间给药后对大鼠神经功能缺损、血肿周围细胞凋亡及凋亡相关蛋白Caspase-3指标的影响。结果 各治疗组血肿周围细胞凋亡率、Caspase-3蛋白表达均明显降低，各治疗组的神经功能评分较对照组明显改善，其中手术同时治疗组和术后6h治疗组与术后12h治疗组、术后24h治疗组比较上述各项观察指标差异有显著性（P<0.01）。结论 早期应用黄芪注射液治疗大鼠脑出血能够显著降低血肿周围区域的细胞凋亡率和Caspase-3蛋白表达率。

    【关键词】 脑出血；黄芪注射液；细胞凋亡；大鼠

     The effect of astragalus propinquns injection on cell apoptosis around the hematoma in the early time after the experimental intracerebral hemorrhage in rats

    MA Quan-rui， XU Dong， ZHANG Lian-xiang， et al.Education and Research Room of Human Anatomy,Ningxia Medical College,Yinchuan 750004,China

    【Abstract】 Objective To study the effect of astragalus propinquns injection on apoptotic cell and caspase-3 protein in the early time after the experimental intracerebral hemorrhage（ICH） in rats. Methods All the ICH rats about the experiment were randomly divided into the remedial group injecting astragalus propinquns and the group without injection. Then the remedial group of rats were divided into four groups which were the instantly treated group， the 6 hours treated group， the 12 hours treated group and the 24 hours treated group. The remedial groups were injected with astragalus propinquns injection once a day. After that all ICH rats were killed on different days to take out their brain in which the immunohistochemical method was performed by using the antibody of caspase-3 protein and TUNEL method was used to detect apoptosis around the hematoma in the brain. To observe the effect of astragalus propinquns injection in different time on the neurological dysfunction， caspse-3 protein expression and cell apoptosis around the hematoma of the brain.Results Compared with the hemorrhage group， the apoptotic rate and the positive cells of caspase-3 protein in the remedial groups were significantly decreased (P<0.01) and neurological dysfunctions were significantly improved .The apoptotic rate of the instantly treated group and 6 hours later treated group decreased significantly compared with that of the 24 hours later treated group(P<0.01).Conclusion When astragalus propinquns injection was used earlier to cure ICH， it can decrease the rate of cell apoptosis and caspase-3 protein expression around the hematoma significantly.

    【Key words】 brain hemorrhage; astragalus propinquns injection;cell apoptosis;

    脑出血是一种严重危害人类生命健康的临床常见病和多发病。据统计，在我国，脑出血占急性脑血管病（脑卒中）的40%～50%，是脑卒中死亡率最高的临床类型，脑出血后30天内病死率接近50%，许多存活者遗留明显的神经功能缺失［1］。目前对高血压脑出血的治疗方法虽较以往有很大进步，如超早期手术、微创技术清除血肿和综合治疗等［2］，但由于影响脑出血疗效的因素是多方面的，脑出血仍具有相当高的死亡率。近年来， 有人尝试采用活血化瘀药黄芪治疗急性期的脑出血，取得了一定的效果［3］，但目前对于该药治疗脑出血的时机和机制问题尚不清楚。基于此问题，本实验欲在不同时间给予黄芪注射液，采用TUNEL染色和Caspase-3免疫组化染色的方法，观察大鼠神经功能缺损、血肿周围细胞凋亡及凋亡相关蛋白Caspase-3指标，以期达到早期应用黄芪治疗脑出血后观察其疗效的目的。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 动物 SD大鼠雌雄不限200只，体重300～350g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，动物合格证号（医动字 第08-005号）。

    1.1.2 主要试剂 黄芪注射液(哈尔滨圣泰制药有限公司，批号Z23020820)；Ⅶ型胶原酶(sigma公司)；TUNEL荧光检测试剂盒（Promega公司），Caspase-3多克隆抗体（北京中衫生物公司），DAB染色试剂盒（武汉博士德公司）。

    1.2 方法

    1.2.1 动物分组 将大鼠（雌雄不限）随机分成4个治疗组：手术同时治疗组、术后6h治疗组、术后12h治疗组、术后24h治疗组和1个出血对照组。各治疗组每日给予腹腔注射黄芪注射液1次，剂量为8ml/（kg·d）（1ml=2g原药材），出血对照组不予治疗。每日进行神经功能评分1次，治疗组分别于第4天和7天处死。

    1.2.2 脑出血大鼠模型制作 根据脑立体定位图谱于大鼠前囟后0.2 ㎜，中线右侧旁开3.0㎜钻孔，暴露硬脑膜。微量进样器吸取1.0μg /μlⅦ型胶原酶0.25μl，以硬脑膜平面为零点，缓慢进针，深度为5.0 ㎜，缓慢注入药物，注射完毕后留针10 min，缓慢退出微量进样器，清洁伤口，缝合头皮，术后保温。

    1.2.3 免疫组织化学染色 石蜡切片，采用ABC法，DAB显色，光学显微镜下观察。在200倍视野下，随机观察并计数血肿周边3个不重复视野的Caspase-3蛋白免疫反应阳性细胞数目。

    1.2.4 细胞凋亡的检测 取与免疫组化染色相邻切片，用末端脱氧核糖核苷转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)。在暗室内荧光显微镜下观片，在200倍视野下，随机观察并计数血肿周边3个不重复视野的TUNEL反应阳性细胞数目。

    1.2.5 结果分析 结果用x±s表示。统计学处理采用SPSS11.5软件包进行方差分析和相关分析，显著性水准均为α=0.05。

    2 结果

    2.1 大鼠神经功能缺损评分 麻醉苏醒后，两组动物均出现不同程度神经功能缺损表现，根据Berderson评分标准对术后各组大鼠进行神经功能评分，各组评分情况见表1，神经功能变化情况见图1。表1 脑出血后各时相点神经功能评分 注：*P<0.01，VS ICH group

    2.2 TUNEL荧光染色 TUNEL荧光染色阳性细胞是核周染色质浓缩呈明亮点状的黄绿色细胞。ICH各组、各时间点凋亡细胞表达情况见表2。 表2 各组血肿周围区TUNEL阳性表达情况注：*P<0.01，VS ICH group; ★P>0.05，VS instantly treated group; △P>0.05，VS 12h group; ● P<0.01，VS instantly treated and 6h group

    2.3 Caspase-3免疫组化染色 Caspase-3染色阳性的神经细胞，胞浆呈棕黄色，高倍镜下观察Caspase-3表达显色深的神经细胞形态较为正常，细胞核尚完整。各治疗组均比出血对照组明显降低(P<0.01)，见表3。 表3 各组血肿周围区Caspase-3蛋白表达情况注：*P<0.01，VS ICH group; ★P<0.05， VS 6 h group; △P<0.01，VS 6h group; ●P<0.01， VS instantly treated group

    3 讨论

    脑出血是一种发病率、病死率和致残率均较高的临床常见病和多发病，迄今为止对脑出血的治疗虽较以往有很大进步，但脑出血急性期仍无肯定、有效的治疗方法，脑出血仍具有相当高的死亡率［2］。 有文献报道临床应用益气消肿药黄芪治疗急性期脑出血患者，取得了一定的效果［3］，但目前对于该药治疗脑出血的时机问题尚不清楚。近几年在脑出血的机制方面的研究取得了一定的进展；文献表明，脑出血后血肿周围脑组织血流量下降，相对于严重缺血性卒中而言属于轻中度脑缺血，轻微脑缺血伴随着大量激活的细胞因子外渗所导致的细胞凋亡，是脑出血后细胞死亡主要途径之一［4］。

    细胞凋亡是一个多步骤发生的受多基因调控的程序性细胞死亡，在很大程度上依赖天冬氨酸特异性半胱氨蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease， caspase)家族的激活。其中caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键酶，在细胞凋亡分子机制网络中居核心地位［5］。Nicholson等［6］ 研究发现敲除Caspase-3基因，大鼠神经系统及大脑发育过程中的程序性死亡被干扰，出现细胞增生发育失控。此结果表明Caspase-3在大脑细胞凋亡中起重要作用。本研究应用相邻切片分别进行Caspase-3免疫组化和TUNEL荧光染色，两者阳性细胞范围及时间变化基本一致。说明caspase-3在脑出血后神经细胞凋亡中起重要调控作用。

    脑出血后脑内血肿，中医认为离经之血，即为瘀血，治法也应活血化瘀。祖国医学认为血瘀是中风的本质，活血化瘀是治疗中风的根本大法，但在治疗时机上存在较大争议。有学者认为活血化瘀不论在早期先驱症状、发作期，还是恢复期均可应用。特别提出，在急性脑血管疾病中，控制出血，不是采取止血方法，而是应用活血止血、化瘀止血、理气止血等法。

    黄芪为传统的益气利水中药之一，含有丰富氨基酸，微量元素硒、铁、锌及黄酮、黄酮类似物、黄芪皂苷类和黄芪多糖等多种成分。据报道黄芪具有提高细胞免疫和体液免疫功能［7］，抗脂质过氧化、降低自由基生成或增加自由基清除、抗氧化及稳定细胞膜，增加组织细胞抗缺血缺氧能力［8，9］。

    本实验结果证明：（1）实验性ICH后使用黄芪注射液治疗有效。（2）6h治疗组和12h治疗组治疗效果优于其他组。从行为学表现来看，在术后12h、24h对大鼠进行神经功能评分，出血同时治疗组神经功能缺失症状明显轻于对照组，术后4天评分发现出血同时治疗组和6h治疗组神经功能明显好于出血对照组。从TUNEL阳性表达情况来看，各治疗组凋亡率低于出血对照组，出血后第4天时间点上6h治疗组与出血同时治疗组差异无显著性，但6h组凋亡率明显低于24h组（P<0.01），12h组与24h组比较差异无显著性（P>0.05）。在7天时间点上，手术同时治疗组和术后6h治疗组凋亡率都显著低于24h组（P<0.01）。从各组Caspase-3蛋白表达情况来看，各治疗组均比出血组明显降低（P<0.01），其中手术同时治疗组和术后6h治疗组都比24h治疗组明显降低（P<0.01），6h治疗组比12h治疗组阳性表达明显降低（P<0.05）。综上所述，黄芪注射液治疗实验性大鼠脑出血可明显减少血肿周围的细胞凋亡率，特别是6h内用药效果优于其他实验组。

    【参考文献】

    1 王永炎，刘柄林.中风病研究述评.中国中医急症，1995，4(2):51-55.

    2 Prasad K，Browman G，Srivastava A， et al.Surgery in primary supratentorial intracerebral hematoma:a meta-analysis of randomized trials.J Acta Neurol Scand，1997，95:103-110.

    3 杨丽阳，曾凯军，王致道. 黄芪注射液治疗脑出血临床观察. 中国中医急症，2002，11(6)：461.

    4 Kohji M，Wei M，Xiaoring W，et al. Evidence for apoptosis after intracerebral hemorrhage in rat striatum.J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(2)：396-404.

    5 金伯泉.细胞和分子免疫学，第二版.北京：科学出版社，2001，202 -208.

    6 Nicholson DW， Ali A.Identification and inhibition of ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis.J Nature.1995，376:37-43.

    7 卢巧风.人参、黄芪对大鼠中性粒细胞趋化影响.同济医科大学学报，1987，16(2)：97-98.

    8 汪德清，沈文梅，田亚平，等.黄芪的三种提取成分对氧自由基作用的影响.中国药理学通报，1994，10(2)：129-132.

    9 汪德清，沈文梅，田亚平，等.黄芪活性提取成分对膜脂质过氧化损伤的防护作用.中国中药杂志，1996， 21(12):746-748.

    *基金项目：本课题为宁夏回族自治区卫生厅科研基金（W2006-02）与宁夏回族自治区教育厅科研基金（J2006-09）资助项目

    作者单位：750004 宁夏银川，宁夏医学院基础学院人体解剖学教研室（Δ通讯作者）

　 (编辑：宋 冰)