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【摘要】 目的 研究艾迪注射液对食管癌凋亡的影响。方法 收集食管鳞状细胞癌病人46例，对照组23例，艾迪组23例，艾迪组术前给予艾迪注射液80ml/d，静脉滴入，连用7天，对照组不用，两组术前其他处理相同。术后完成常规病理检查后，应用组织芯片技术，采用免疫组化法检测Bcl-2、Bax；原位末端核苷酸标记(TUNEL)法检测癌细胞凋亡状况。结果 两组在性别、年龄、部位、癌肿大小、分化、浸润深度、淋巴转移方面差异均无显著性，具有可比性。 Bcl-2在艾迪组的表达阳性率（39.1%）比对照组（78.3%）显著降低，具有统计学差异（P＜0.05），Bax在艾迪组的表达阳性率（56.5%）比对照组（17.4%）显著增高，具有统计学差异（P＜0.05）。艾迪组的Bax/ Bcl-2比值(1.22±0.72）比对照组（0.47±0.65）增高，差异有非常显著性（P＜0.01）。TUNEL法检测：艾迪组癌细胞凋亡阳性率（69.6%）比对照组（8.7%）明显增高，两组间差异有非常显著性（P＜0.01）。结论 艾迪注射液可以通过下调Bcl-2蛋白的阳性表达，增大Bax/ Bcl-2的比值、诱导癌细胞凋亡，从而发挥对食管癌的术前干预作用。应用组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的，具有快速、经济、准确的特点。
【关键词】 艾迪注射液; 食管鳞状细胞癌; 组织芯片; 凋亡
Study on the influence of apoptosis in Aidi injection on patients with esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) by tissue microarray
WANG Jian-rong,LAI Ren-sheng.Basic Medical College of Nanjing University of TCM,Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM , Nanjing 210029,China
【Abstract】 Objective To study the influence of apoptosis in Aidi injection on patients with ESCC. Methods 46 ESCC patients were divided into Aidi group and control group, each of which included 23 subjects. Patients of Aidi group were given 80ml/d intravenous injection of Aidi for 7 days before surgery, while patients of control group were not given any Aidi injection. Other related therapeutic medicines were as same in both groups. After completing ordinary staining detection, tissue microarray (TMA) was prepared and performed using immunohistochemistry (IHC) and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP biotin end labeling of fragmented DNA(TUNEL) method. Bcl-2 and Bax were observed by immunohistochemistry staining. Results There was no significant statistical difference between the two groups in sex, age, tumor sites, tumor size, differentiated degree, infiltration degree or lymph node metastasis. The positive rate of Bcl-2 in Aidi group（39.1%）was significantly lower than those in control group（78.3%）,（P＜0.05）,while the rate of Bax in Aidi group（56.5%）was significantly higher than that in control one（17.4%）,（P＜0.05）. The ratio of Bax/ Bcl-2 in Aidi group (1.22±0.72) was significantly higher than that in control group(0.47±0.65),（P＜0.01）. In addition, the positive rate of apoptosis in the experimental group(69.6%) was significantly higher than that in the control group(8.7%)（P＜0.01）by TUNEL method. Conclusion Aidi injection could downregulate the expression of Bcl-2 and increase the ratio of Bax/ Bcl-2 to improve the apoptosis of ESCC, therefore it can interfere with ESCC prior to surgical operation. It is feasible to use tissue microarray technique, which is a rapid, economic and accurate method to screen clinical tissue specimens on a large scale.
【Key words】 Aidi injection; esophageal squamous cell carcinoma; tissue microarray;apoptosis
食管癌是一种常见的发病率较高的癌症，预后较差，选用任何单一方法治疗,如手术、放疗或化疗等,其疗效均不尽如人意。 综合治疗则能取长补短,最大限度地发挥各种疗法的优势。
中医药在食管癌的各个阶段均可应用，并有明显的疗效。术前应用中药可为手术切除肿瘤作准备，能改善患者心、肝、肾等脏器的功能；能控制癌症的发展，增加手术切除率,减少手术并发症等。中医药与手术的配合可有效增强免疫功能,提高患者的生存质量及远期生存率。
艾迪注射液是一种新型多靶点抗肿瘤药，属于目前临床常用的中药复方精制剂，临床已经证实艾迪注射液对食管癌等多种肿瘤有明显的疗效，但同大多数中药一样，其作用的分子机制尚不完全明了。我们用组织芯片的方法，分析了多项凋亡相关指标，探讨艾迪注射液对食管癌术前干扰的分子机制。
1 资料与方法
1.1 研究对象 本实验研究设计为回顾性研究，共观察江苏省中医院胸外科2003年8月～2005年12月收治的食管鳞状细胞癌手术病人46例，其中实验组23例，对照组23例。 所有病例术前均经电子内镜及组织病理学检查证实为食管鳞状细胞癌，无远处转移，术前未经放化疗或免疫治疗。
1.2 临床试验用药及处理方法 艾迪注射液：生产厂家贵州益佰制药有限责任公司；批准文号：国药准字Z52020236。艾迪组术前给予5%葡萄糖注射液500ml＋艾迪注射液80ml静滴，QD×7d;对照组不用艾迪注射液，其他处理方法相同，均行食管癌根治，胸腹二野淋巴结清扫术。
1.3 主要试剂 Bcl-2、Bax 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供；即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒，福州迈新生物公司提供；原位末端核苷酸标记(TUNEL)检测细胞凋亡试剂盒：由德国罗氏公司提供。
1.4 实验方法
1.4.1 标本收集 收集2003年8月～2005年12月，南京中医药大学附属医院病理科归档食管鳞状细胞癌蜡块，回顾性分析其病历资料，符合艾迪组要求的23例，对照组23例。
1.4.2 常规病理学检查 观察肿瘤的部位、大小、浸润深度、大体类型，淋巴结转移情况，常规HE染色。
1.4.3 组织芯片的制作 （1）HE染色切片定位，镜检观察组织，标定切片靶点位置，对照标定相应蜡块区域。（2）玻片洗净，APES包被后备用。（3）选择正常组织作为A1区位指示组织，本项目为正常食管鳞状上皮组织。（4）浇注4.0cm×2.0cm宽体区受体蜡块。 8×6=48孔矩形打孔每孔0.2mm。（5）供体蜡块1～47号按上述顺序编号，每只石蜡块均有A1-F7各位点编号（见图1）。(6)供体蜡块固定于打孔仪下方用带内芯的不锈钢2mm内径空针，在已选定的区域，钻孔取芯柱2mm深度，立即转移到受体石蜡对应孔中，以内芯退出芯柱组织，如此反复47次完成受体蜡块的制作，37℃加温受体蜡块，挤平受体块组织芯柱，冻存受体蜡块。(7)切片前以薄膜贴住受体蜡块，6mm切片以后反面向下漂入温水，APES玻片准确捞片（方向固定）立即用紫外灯照射15s，揭掉薄膜，在80℃下烤片2h，保存玻片备用。(8)组织芯片质量控制：芯片组织排列整齐、完整，免疫组化染色时基本无皱褶、无掉片、无缺损、无变形，质量良好。
1.4.4 免疫组化及凋亡检测 免疫组化采用SP两步法（具体步骤略）。通过原位末端核苷酸标记法( terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end labeling ，TUNEL ) 技术检测癌细胞凋亡状况（具体步骤略）。
1.5 分析方法 Bcl-2 、Bax评分标准：根据食管癌组织中免疫组织化学染色的深浅和阳性细胞百分数进行评分:阳性细胞百分数<5%，未被染色为阴性(－)；5%～25%，浅棕色为弱阳性(±)；25%～50%，棕色为阳性(+) ；50%～75%，深棕色为中度阳性(++)；＞75%，棕褐色为强阳性(+++)。为了统计方便，予以半定量计分: 0、1、2、3、4，分别对应－、±、+、++、+++。将染色强度“－、±”合计为阴性，“+、++、+++”合计为阳性。凋亡的评分标准：<10%细胞核未被染色或浅棕色为阴性，＞10%细胞核棕色为阳性。
1.6 统计学分析 数值变量以均数、标准差或中位数表示；两组样本均值的比较采用t检验；采用SPSS12.0统计分析软件进行，有关检验给出检验统计量及其相对的P值，用Fisher精确概率法时直接给出P值。以P＜0.05作为差异有显著性，以P＜0.01作为差异有非常显著性。
2 结果
2.1 两组病例基本情况比较 见表1。表1 两组病例基本情况比较
2.2 Bcl-2、Bax免疫组化染色结果 见表2～6。表2 艾迪组与对照组Bcl-2、Bax评分比较表3 艾迪组与对照组Bcl-2表达结果比较注：P＝0.016，P＜0.05，差异有显著性表4 艾迪组与对照组Bax表达结果比较注：P＝0.013，P＜0.05，差异有显著性表5 两组Bax/ Bcl-2比值比注：两组Bax/ Bcl-2比值比较，P＝0.002， P＜0.01，差异有非常显著性表6 两组组织芯片原位末端标记法检测凋亡阳性率 注：P=0.000， P＜0.01 ， 差异有非常显著性
3 讨论
食管癌属于中医的“噎膈”、“反胃”范畴。早在《山海经·五藏山经·中次七经》就有“咽”病的记载“咽”病即“噎”病。《黄帝内经》记载了“膈病”的症状和病因病机。其病位在食管,属胃气所主,又与肝脾肾密切相关。食管癌病因有：忧思郁怒、饮食酒伤、正气虚弱等。其病机实者多系气、血、痰互结于食管,虚者系津血日渐枯槁。以正虚为本,气滞、痰凝、瘀结为标,属本虚标实,治宜扶正祛邪,标本兼治。
根据食管癌的病因病机，我们以扶正祛邪为主要治法，配以活血化瘀之法，选择艾迪注射液应用于食管癌患者的术前治疗。艾迪注射液是目前临床常用的中药复方抗肿瘤制剂，其主要成分是:黄芪、人参、刺五加、斑蝥等，是按扶正祛邪的原则进行治疗。
近年研究发现某些中药能够有效地诱导肿瘤细胞凋亡。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。1992年英国科学家Hickman等提出将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究中的主要目标和手段。因此，我们用组织芯片的方法研究艾迪注射液对食管癌凋亡的影响。
组织芯片(tissue microarray)是将数十至上千个小组织整齐地排放在一张载玻片上而制成的组织切片。组织芯片的特点是:体积小，信息含量大，一次性实验即可获大量结果［1］ (high-throughput)。 在大量的科学研究中，因其实验条件的一致性，而使实验结果的准确性及科学性有了保证，检测结果就有了充分的可比性。该技术不仅适合组织形态学观察，还可用于免疫组化、原位杂交、凋亡等研究。
细胞凋亡(apoptosis) 或称程序性细胞死亡(PCD) 是指细胞按自身规定程序主动结束生命的细胞“自杀”现象，受凋亡相关基因(如Bax，Bcl-2等)的表达调控。机体细胞数量的恒定取决于细胞增殖和凋亡之间的动态平衡，肿瘤的发生发展与这种平衡发生破坏密切相关。
Bcl-2基因家族在细胞凋亡的调控中有重要作用，其中抑制凋亡的B淋巴细胞瘤/白血病-2基因(b-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)和促进凋亡的Bax基因(编码Bcl-2相关蛋白X的基因)是一对相关的重要调控基因，Bcl-2基因定位于染色体18q21，为一抑制细胞凋亡基因。Bcl-2基因在正常食管黏膜中不过度表达，在ESCC 和癌旁非典型增生组织中表达增高，研究还发现Bcl-2基因表达与肿瘤分化程度有关，肿瘤分化程度越高Bcl-2基因阳性表达率也越高［2］。
分布于线粒体外膜上的Bcl-2 蛋白通过稳定线粒体膜，防止线粒体内促凋亡相关蛋白泄漏至胞质及阻断Ca2+ 从内质网释放，使依赖Ca2+ 的核酸内切酶活性降低等途径阻断细胞凋亡［3］。Bax 为Bcl-2 相关蛋白，可与抗凋亡蛋白Bcl-2 形成异源二聚体，具有抑制Bcl-2，从而促进细胞凋亡的作用，是细胞凋亡的重要调控基因，Bcl-2 与Bax 的比值将影响细胞的凋亡。Oltvai等［4］ 和Wyllie等［5］ 研究表明Bcl-2基因和Bax基因的相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白可形成异源二聚体，Bax之间可形成同源二聚体，且异源下二聚体抑制凋亡，Bax同源二聚体则促进凋亡，因此认为Bcl-2与Bax比率的升降可调节细胞的凋亡，调高Bax/Bcl-2则促进凋亡，降低Bax/Bcl-2则抑制凋亡。本实验，Bcl-2、Bax 在艾迪组的阳性率分别为39.1%、56.5% ；在对照组的阳性率分别为78.3%、17.4% 。Bcl-2 在艾迪组的表达阳性率比对照组显著降低，而Bax则显著增高，两者均具有统计学差异（P＜0.05）。艾迪组的Bax/Bcl-2比值（1.22±0.72）比对照组（0.47±0.65）增高，差异有非常显著性（P＜0.01）。TUNEL法检测癌细胞的凋亡结果显示，艾迪组癌细胞凋亡阳性率（69.6%）比对照组（8.7%）明显增高，两组间差异有非常显著性（P＜0.01）。由此推断，艾迪注射液有促进癌细胞凋亡作用。
综上可以看出，艾迪注射液有诱导癌细胞凋亡作用，其机制可能与下调Bcl-2蛋白的阳性表达，增大Bax/ Bcl-2的比值有关。术前注射艾迪注射液能诱导癌细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。
【参考文献】
1 周小鸽，张劲松，张小平，等. 组织芯片.中华病理学杂志，2002,31(1):70-72.
2 闫增荣,王秀琴,闫各,等.Bcl- 2基因在食管癌中的表达与食管癌危险因素的关系. 兰州医学院学报,2004 ,30(3):7- 9.
3 Mertens HJ, Heineman MJ, Evers JL. The expression of apoptosis related proteins Bcl-2 and Ki67 in endometrium of ovulatory menstrual cycles. Gynecol Obstet Invest , 2002 , 53(4): 224- 230.
4 Oltai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ, et al. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death .Cell, 1993, 74(4):609-619.
5 Wyllie AH. Death gets a brake. Nature,1994,369:272-273.
作者单位：210029 江苏南京，南京中医药大学基础医学院