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【摘要】 目的 观察黄芪甘草水提物（AG）的抗诱变作用。方法 观察黄芪甘草水提物对环磷酰胺诱变小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能、血清溶血素及溶血空斑形成的影响。结果 黄芪甘草水提物可显著提高正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬率,促进溶血素及溶血空斑形成,并显著对抗由环磷酰胺造成的诱变损伤。结论 黄芪甘草水提物有显著的抗诱变作用。
【关键词】 黄芪（A 甘草（G 抗诱变；环磷酰胺
黄芪自古以来就被《神农本草经》列为上品, 具有补气升阳、益卫固表等功效。甘草有“国老”的尊号, 中医处方离不开甘草,俗称“十方九草”,自古至今,广为药用, 具有清热解毒、止渴祛痰、补脾和胃、调和诸药等功效。两者对免疫系统、内分泌系统等均具有广泛的影响，因此配伍应用极具临床潜力，对AG抗诱变机制的探索将为开辟中药防治病毒感染、恶性肿瘤及其他疾病的新途径提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器 黄芪甘草水提物（AG）：黄芪（A）50g，甘草（G）25g ，粉碎后加入500ml蒸馏水，浸泡30min，在烧杯中反复煎煮3次，收集药液，过滤去渣，沸腾水浴至100ml,药物浓度相当于50倍人常用剂量［1］， 4℃冰箱保存待用。环磷酰胺（ＣＰ）由上海华联制药有限公司生产，腹腔注射40mg/（kg·bw）［2］。维生素Ｃ（VitC）由合肥第四制药厂生产，灌胃40mg/（kg·bw）［3］。MTT（噻唑兰）、 ConA（刀豆蛋白A） 为美国sigma 公司产品。二甲基亚砜（DMSO）为北京化工厂产品。绵羊红细胞（SRBC）、鸡红细胞、豚鼠血清，无菌抽取动物血液制备, 4℃冰箱保存备用。
1.2 实验动物 封闭群昆明种小鼠,体重18～22g，由四川农业大学动物实验中心提供，清洁级。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 溶血空斑形成细胞（PFC） 的测定［4］ 小鼠60只，雌雄各半，按随机数字表法随机分成6组：阳性对照组、AG组、AG+CP组、VitC组、VitC+CP组、阴性对照组，每组10只。根据预实验确定AG最佳实验剂量为50倍人临床常用剂量。每天灌胃1次,每只0.5ml，共灌胃14天。阳性对照组、AG+CP组和VitC+CP组动物处死30h前腹腔注射CP 1次，给药容量1×10-3ml/（kg·bw）。采用改良的SRBC 定量溶血试验法。灌胃第8天每鼠腹腔注射5%SRBC 0.2ml（约含2×108SRBC）免疫动物，第14天取脾细胞经PBS洗涤（ 2000rpm, 5min ） 2次后, 以Gey’s 调细胞为5×106ml,取此细胞悬液1ml, 加0.2%SRBC 1ml及1：30 （用PBS 稀释,v/v）豚鼠血清补体1ml, 37℃水浴1h, 离心3000rpm, 5min,取上清于712 分光光度计413nm 处测OD 值, 设不加脾细胞的空白对照管; 每一样品做两只复管。
1.3.2 巨噬细胞吞噬功能测定 另取小鼠60只，实验分组及给药方法同上，灌胃第13天每只鼠腹腔注射10g/L淀粉溶液2ml,24h后,腹腔注射2%鸡红细胞1ml,30min后,小鼠脱臼处死,腹腔内注射0.2ml肝素注射液,揉动腹部,毛细管吸取腹腔液,滴一滴于玻片上,将毛细管平放于液滴上展开液滴,自然干燥,瑞士-姬姆萨染液染色5min,pH7.2，PBS浸泡5～6min,自然干燥后,油镜观察。
结果判定:观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况,记数100个巨噬细胞,以及其中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数,计算吞噬百分率。
吞噬百分率＝（吞噬鸡红细胞数/100 个巨噬细胞）×100%
鸡红细胞悬液的制备：于无菌条件下,自鸡翅下静脉采血,置100ml疫苗瓶中,加入相当于鸡血体积5 倍的Alsever’s 溶液（枸橼酸三钠2H2O 8.0g ,枸橼酸0.5g ,无水葡萄糖18.7g ,氯化钠4.2g ,蒸馏水1000ml ,溶解,过滤,分装,高压消毒,4℃冰箱保存备用） 混匀,4℃冰箱贮存。临用时,用生理盐水洗涤3次, 前2次离心速度为1500r/min,离心5min,弃上清液和界面的白细胞层。最后应连续2次离心（2000r/min,5min），直至红细胞压积值恒定。按此值用生理盐水配成（2%和5%,v/v） 红细胞悬液。
1.3.3 血清溶血素的测定 另取小鼠60只，实验分组及给药方法同上，于第1日每鼠腹腔注射鸡红细胞悬液0.2ml,末次给受试药物1h后,摘除眼球取血,分离血清,用生理盐水将血清稀释100倍,取稀释血清1ml,与5%鸡红细胞悬液0.5ml、10%豚鼠血清0.5ml 混合,在37℃恒温箱中温育30min ,置0℃冰箱中中止反应,离心,取上清液于721型分光光度计540nm 处比色,测定吸光度。
1.4 统计学处理 数据以x±s表示,使用SPSS统计分析软件处理，采用t检验和卡方检验进行统计分析。
2 结果
AG能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率，能显著促进溶血空斑和血清溶血素的生成。见表1。 表1 AG对小鼠PFC、巨噬细胞吞噬率、血清溶血素的影响注：与阴性对照组比较,aP<0.05;与VitC组比较,bP<0.05;与阳性对照组比较，cP<0.05;与VitC+CP组比较,dP<0.05
3 讨论
表1中的光密度值（OD）的大小反映了小鼠溶血空斑和血清中溶血素水平的高低，OD值1越大，表示溶血空斑越大，OD值2越大, 表示溶血素含量越高，两者呈正相关关系。由表1可见，AG组OD值显著高于阴性对照组、阳性对照组和VitC组（P<0.05），AG+CP组显著高于VitC+CP组和CP组，说明AG能明显促进溶血空斑形成，促进B细胞分泌功能，增强其抗体产生能力，明显促进鸡红细胞致敏小鼠溶血素的生成，并明显对抗CP对机体的抑制。
巨噬细胞是机体免疫监视功能的重要效应细胞, 在体内具有非特异性吞噬功能, 亦能通过抗原递呈作用活化TH和B细胞增强特异性免疫应答［5］。由表1可见，AG可使小鼠腹腔巨噬细胞功能增强，增加其吞噬能力，显著对抗CP对细胞免疫的抑制。AG通过对巨噬细胞功能的增强间接促进特异性免疫应答,促进多种免疫细胞的协同作用。
本研究检测了体液免疫指标（溶血素、PFC） 、 非特异性免疫指标（巨噬细胞吞噬实验），结果表明AG具有明显的抗诱变作用。中药抗突变研究进展很快,前景非常广阔，但应该指出的是,目前运用分子生物学方法来研究中药抗突变的分子机制才刚刚起步,加上实验材料大多来自体外或动物实验,距临床实际应用还有一段距离。
【参考文献】
1 邱世翠,李波清.黄芪对小鼠免疫功能的影响. 时珍国医国药，2000，11（5）：339-340.
2 施荣山，朱萱萱，邱召娟. 党参黄芪水提取物抗突变作用的研究. 现代预防医学,1997,24（3）:335-337.
3 黄晓沐，姜宗荣. 生源健身茶的诱变性与抗诱变性研究. 中国食品卫生杂志,1996,8（6）:4-7.
4 Simpson MA. Spectropho tometric determinationn of lymphocyte mediated red blood cell hemolysis in vitro. J Immunol Methods, 1978, 21: 159.
5 竺心影.药理学，第3版.北京:人民卫生出版社，1993,412-413.
作者单位：625000 四川雅安，雅安职业技术学院医学系生理教研室