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【摘要】 探讨了ACE（血管紧张素转换酶）抑制活性的检测方法, 并以贻贝为原料制取降血压肽，研究了不同酶解条件对其ACE抑制活性的影响，然后利用SHR饲喂试验检测其降血压活性。结果表明，降血压肽有较好的ACE抑制活性：其ACE抑制率可达88.08%。同时动物试验表明其降压效果明显, 在SHR饲喂后2～6h之内均有显著降压效果，平均降低为16～28mmHg。
【关键词】 降血压肽 血管紧张素转换酶抑制活性 降血压
Study on the ACE inhibitory activities and antihypertensive effects of antihypertensive peptide
WANG Yi-fan， WU Jin-chao , FANG Chang-fu.Second Institute of Oceanography, SOA, Hangzhou, Zhejiang 310012, China
【Abstract】 The testing method of ACE inhibitory activities was studied, and the antihypertensive peptides were derived from mytilus coruscus, then the ACE inhibitory activities were studied on different conditions; the antihypertensive effects were tested by SHR-feeding method. The results were as follows: the antihypertensive peptide had strong ACE inhibitory activities, the ACE inhibitory ratio was 88.08%, and the antihypertensive effect was obvious in 2 to 6 hours, the average reduced breadth is 16～28mmHg.
【Key words】 antihypertensive peptide；angiotensin-converting enzyme（ACE）inhibitory activities； antihypertensive effects
降血压肽实质是一种血管紧张素转换酶抑制肽，它通过抑制血管紧张素转换酶（ACE），阻碍有升高血压作用的血管紧张素Ⅱ的生成，同时抑制具有降血压作用的血管舒缓激肽的分解，从而使血压下降，此即降血压肽的作用机理［1］。
近年来国际学术界对降血压肽的研究较多，已报道有以牛奶、乳酪、大豆、鱼肉、蔬菜、小麦蛋白等食物为原料，经蛋白酶酶解产生了具有较好ACE抑制活性的降血压肽［2～7］。Eiji等［8］水解了12种食物蛋白进一步研究发现，从鱼肉、虾、蟹等水产动物蛋白中制得的降血压肽其降压活性优于其他食物性蛋白。我国在降血压肽领域的研究起步相对较晚，现有报道以大豆、蛇毒、老酒、茶叶为原料，对降血压肽的制备工艺和活性基团等方面进行了一定研究［9～13］；对于最适合用于降血压肽制备的水产动物蛋白的开发研究，则鲜有报道。
贻贝，又名海红、淡菜，近年来人工养殖取得重大成功，在我国东南沿海产量丰富。但由于加工手段和技术的落后，在收获季节产出的大量贻贝因得不到及时处理而造成极大浪费［14］。本研究以贻贝为原料，经酶解、活性修饰等方法制取降血压肽，然后利用SHR饲喂试验检测其降血压活性，并分析了其相对分子质量分布和氨基酸组成，以期为贻贝酶解降血压肽的开发提供理论探索。
1 材料与方法
1.1 材料与设备 贻贝：市售。ACE标准样品：Sigma试剂。 复合生物酶P1 （本项目组自行配制），其组分均购自上海生物化学试剂公司。降血压肽制备所需其他试剂，均为生化纯，上海生物化学试剂公司提供。降压功能试验用动物：SHR（自发性高血压大鼠），上海高血压研究所提供。仪器设备：HPLC（Waters 600高效液相色谱仪），大鼠血压仪（RBP-1B）及常用试验仪器若干。
1.2 实验步骤
1.2.1 ACE活性抑制检测方法研究 酶解降血压肽对ACE的抑制活性分析原理为：ACE与HHL（Hip-His-Leu）作用会生成Hippuric Acid，当HHL的量一定时，Hippuric Acid的生成量与ACE的活性呈线性关系，而由于酶解降血压肽的作用，会抑制ACE的活性，从而使反应生成的Hippuric Acid量减少，通过检测生成的Hippuric Acid的含量，对比ACE的活性，即可分析出酶解降血压肽的抑制活性。
1.2.2 降血压肽的制备 根据本项目组前期研究经验和国际新近研究成果，结合有关蛋白酶酶解的作用特点，选取复合蛋白酶P1，在不同酶解条件下对贻贝蛋白进行酶解，采取Uniform Design（均匀设计）方案［15］，研究不同酶量、酶解时间、酶解温度、pH等四大因素下对ACE的抑制效果。选择最佳的酶解条件。
按上面实验所确定的酶解条件，取新鲜贻贝去壳，捣碎，酶解，纯化，然后加入活性修饰剂MA1, 提取，冷冻干燥，制备降血压肽，以备分析检测之用。
将制备的降血压肽样品利用SHR饲喂试验来分析其降压活性。
1.3 实验方法
1.3.1 ACE活性抑制检测方法研究 取标准Hippuric Acid样品（光谱级），配制成0.1M溶液，参考前述有关文献, 分别稀释至0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mM；以及0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mM两组不同浓度，分别于228nm下测定其吸光值，记录结果。
1.3.2 酶解样品ACE抑制效果的分析 用紫外分光光度法分析不同酶解条件下制备的酶解降血压肽对应的ACE抑制活性。参照上述研究结果，并借鉴Cushman［16］和后经Toshiro［17］改进的方法进行。
将各酶解液反应值与空白样品对照，分析所得酶解降压肽的ACE抑制率P。计算公式为：
P=A－A （control） A×１００%
1.3.3 降血压肽降压功能检测 实验用动物: SHR, 均由上海市高血压研究所提供, 全部为雄性, 16周龄, 体重为250～300g。实验前分析各组血压、体重、周龄等比较差异均无显著性（P>0.05）。用8只SHR为一组，共分为5组，另取8只为空白组进行对照。
测量方法：尾动脉法测量收缩压SBP。
2 结果
2.1 ACE抑制活性检测方法的研究 不同浓度Hippuric Acid吸光值结果见表1、表2及图1、图2。表1 不同浓度Hippuric Acid吸光值 （0.01～0.05mM）表2 不同浓度Hippuric Acid吸光值 （0.10～0.50mM）
2.2 酶解条件对降血压肽ACE抑制率的影响 将在不同的酶解条件下处理所得降血压肽样品按前述方法进行ACE抑制活性的检测,分析其ACE活性抑制率,研究不同酶解条件对降血压肽ACE抑制率的影响,结果见表3。
2.3 降血压肽的降压效果 降血压肽样品动物试验，将样品以3.0g/kg体重的样品剂量进行灌喂。灌喂前和灌喂之后第2、4、6、8、10h分别检测收缩压一次，记录各血压值。结果见表4。
2.4 统计学分析 采用各组别服用降血压肽前后收缩压的变化情况来反映降压效果，数据以x±s表示，采用SPSS11.0 for Windows 系统处理数据，并进行单因素方差分析，各组间进行Dunnett t多重比较。分析结果见表5。表3 不同酶解条件对ACE抑制效果影响 表4 降血压肽样品对收缩压降压效果 注：（α＝0.05）★（α＝0.01）★★
3 结论
3.1 ACE抑制活性检测方法的研究 分析0.01～0.05mM和0.10～0.50mM的数据，可发现Hippuric Acid在浓度范围为0.01～0.05mM内线性最佳，因此应控制有关反应使最终的Hippuric Acid浓度在此范围之内，提高检测的准确性。
3.2 P1酶最佳酶解条件 对于ACE抑制结果进行回归分析，所得回归方程为:
Y=70.464-1.195X1+15.299X2+11.971X3-4.310X22+0.194 X1X2-0.141X3X4
根据方程分析最佳的ACE抑制活性为90.23%。
但由实验结果在此条件下的实际ACE抑制率为86.55%, 所以NO1为最佳条件。其ACE抑制率为88.08%，对应的最佳酶解条件为：酶量25IU/ml；酶解时间2h；pH 7.0；酶解温度60℃。
具体分析P1的酶解情况，酶量从25IU/ml到175IU/ml，酶解时间2～7h, 随着酶量的增加和酶解时间的延长，其酶解程度增加，但所得降血压肽的ACE抑制率下降。这是因为随着酶解的进行, 蛋白质逐渐被水解成不同长度的肽断，其中部分因结构上的某些活性基团而具有降血压活性；但随着酶解程度提高，部分具有ACE抑制活性的短肽被酶解成氨基酸或其活性基团被破坏，从而导致其ACE抑制活性下降。这一点与Kim等［18］通过牛皮胶制备酶解降血压肽的研究得到的结论相吻合，在酶解过程中控制酶解程度非常重要，既要使蛋白质得到充分的酶解，使更多的活性肽断被水解出来，但同时又要适当控制酶解程度，即并非酶解程度最大时其降压活性最好。
3.3 降血压肽的降压效果 由方差分析结果，查表得F0.05（2,9）＝4.26，可知对于处理4h和6h血压变化的F值＞F0.05（2,9），说明服用降血压肽4h和6h效果差异有显著性（α＝0.05）。
同时，由上述实验结果可知，降血压肽在2～6h之内均有显著降压效果（α＝0.05），平均降低为16～28mmHg。在6h处降压效果达到最大值为28mmHg，且效果极为显著（α＝0.01）。
根据国内外大量随机对照的临床试验结果，收缩压降低10～14mmHg和舒张压降低5～6mmHg，冠心病减少1/6，总的主要心血管事件减少1/3［19］，从这个意义上讲，贻贝酶解降压肽的降压效果非常显著，随着今后进一步研究，其有望作为一种高品质的食品、药品原料而大有用途。
3.4 意义 作为世界第一水产大国，我国的水产品深加工水平却相当落后，产品的附加值较低且市场前景有限。对于应用水产原料进行降血压肽的开发研究工作还比较落后。鉴于以上情况，加大从水产动物蛋白中研制开发具有较高降血压活性的降血压肽，则对于缓解以上问题有较为积极的意义。
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作者单位：310012 浙江杭州,国家海洋局第二海洋研究所