点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨甲氨喋呤（MTX）和雷公藤多甙（TG）对类风湿关节炎（RA）滑膜细胞产生CC趋化因子受体5配体（CCL5）的影响。 方法 分离于11例RA和6例骨关节炎（OA）的滑膜细胞行体外培养，并用细胞脂多糖（LPS）诱导CCL5产生，同时加入或不加入不同浓度的MTX或TG。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定培养上清液中的CCL5水平。 结果 RA滑膜细胞体外自发产生CCL5水平高于OA滑膜细胞（P<0.05）;LPS刺激后，RA和OA滑膜细胞产生CCL5水平均较刺激前显著升高（P均<0.001），但二者间差异无显著性（P>0.05）;MTX和TG均可显著抑制RA滑膜细胞产生CCL5，但二者抑制方式不同:MTX剂量在5～20ng/ml的剂量范围内呈现剂量依赖性效应，之后随剂量的增大，其抑制作用不再进一步增强。而TG未显示出剂量依赖性抑制效应，仅在剂量达到或超过60ng/ml时出现比MTX更显著的抑制作用。进一步分析发现，TG抑制CCL5产生与其所致的滑膜细胞死亡相关。 结论 RA滑膜细胞产生CCL5增高，MTX和TG均可显著抑制CCL5的产生，其中TG抑制CCL5产生与其细胞毒作用有关。
The inhibitory effects of methotrexate and tripterygium glycosides on chemokine CCL5production in synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis
Wei Jin，Yuan Guohua，Zhou Jingguo，et al.
Research Institute of Rheumatology and Immunology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong637000.
【Abstract】 Objective To determine the inhibitory effects of methotrexate（MTX）and tripterygium glycosides（TG）on chemokine CCL5production in synoviocytes isolated from patients with rheumatoid arthritis（RA）.Methods Synoviocytes，isolated from RA patients and patients with osteoarthritis（OA），were cultured and stimulated with or without lipopolysaccharide（LPS）in the presence or absence of different dosage of MTX or TG.CCL5level in cultural supernatants was measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Results RA synoviocytes sponta-neously produced higher level of CCL5than OA synoviocytes did.BothMTX and TGwere found to significantly inhibit LPS-induced CCL5production in RA synoviocytes.Moreover，the inhibitory effect of MTX appeared to be in a dosage dependent manner in the concentration ranged from0-20ng/ml.Whereas TG showed its inhibitory effect only when it reached at the concentration of60ng/ml.Furthermore，the inhibitory effect of TG was found to be correlated with TG-induced cell death.Conclusion The increased production of CCL5by RA synoviocytes indicates a role of CCL5in the pathogenesis of RA，and the disease modifying effects of MTX and TG might be existed through their anti-CCL5effect.
【Key words】 arthritis rheumatoid chemokines CC CCL5
类风湿关节炎（RA）是一种常见的慢性炎性关节炎，其病理特征为大量炎性细胞在滑膜的浸润和在滑液的渗出，及由此导致的滑膜增生，血管翳形成，最终造成关节软骨破坏。近期的研究结果显示，趋化因子（chemokine）在RA的炎性细胞关节浸润中起着极为重要的作用 ［1］ 。我们发现RA患者血清和滑液CC趋化因子受体5（CCR5）的配体CCL5（RANTES）水平增高，并证实滑膜细胞是其产生的主要部位，并且在用甲氨喋呤（MTX）和雷公藤多甙（TG）治疗后，CCL5水平下降 ［2，3］ 。为了进一步探讨MTX和TG在RA滑膜细胞产生CCL5的作用，我们通过体外滑膜细胞培养方法，观察MTX和TG对RA滑膜细胞产生CCL5的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料 在本院就诊的、有膝关节积液的RA患者11例，男3例，女8例，年龄21～68岁，平均年龄41岁，病程6个月～18年，平均7.4年。所有病人均符合美国风湿病学会1987年的RA诊断标准 ［4］ ，且近1个月内未用改变病情药物（DMARD）和甾体类激素。另选择有膝关节积液的OA患者6例作为对照组，其中男2例，女4例，年龄42～78岁，平均年龄49.3岁，病程2.6～12年，平均9.3岁。
1.2 滑膜细胞的分离与培养 实验采用滑液中的游离滑膜细胞进行培养。患者在无菌条件下行膝关节穿刺，抽取关节液后，在4℃1000r/min离心10min，去上清后用无菌冷PBS10ml悬浮细胞，经100目尼龙网过滤去除凝块沉渣，细胞再用冷PBS洗2次后，悬浮于DMEM培养液（含10%小牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素），混匀后取10ml行台盼蓝染色，活细胞计数。收集到的细胞接种于培养皿，置CO 2 自动控制培养箱，于37℃培养12h后，更换培养液去除非粘壁细胞，重复2～3次，至显微镜下观察绝大部分细胞呈梭状成纤维样细胞为止。用胰蛋白酶法收集滑膜细胞，按10 5 细胞/ml，每孔0.5ml复种于24孔培养板。
1.3 滑膜细胞刺激 在预实验中发现，体外培养的滑膜细胞产生CCL5浓度较低，不利于观察MTX和TG的作用，为此我们加用5μg/ml的细菌脂多糖（LPS）刺激滑膜细胞CCL5的产生，同时加入或不加入不同浓度的MTX或TG，培养48h，收集上清，置-30℃保存备用。
1.4 CCL5测定 采用酶联免疫吸附（ELISA）方法，CCL5定量测定试剂盒（美国R&D公司生产）测定敏感度为3.1pg/ml，操作按试剂盒说明书进行。
1.5 统计学处理 两者间计数资料用t检验，CCL5水平与药物浓度的相关性分析采用直线相关回归分析。
2 结果
2.1 RA和OA滑膜细胞体外产生CCL5的检测结果 见图1。由图1可见，RA滑膜细胞体外产生CCL5较OA滑膜细胞明显增高（P<0.05）。用LPS刺激后，RA和OA滑膜细胞产生CCL5均较未刺激的滑膜细胞显著增高（P<0.001）。
图1RA和OA滑膜细胞体外产生CCL5的检测结果
2.2 MTX和TG对RA滑膜细胞产生CCL5的影响 见图2。由图2可见，MTX和TG均可显著性抑制LPS诱导的RA
图2 MTX和TG对RA滑膜细胞产生CCl5的影响
滑膜细胞产生CCL5。MTX的抑制效果随剂量增大而增强，当浓度为20ng/ml时达最大效果，之后其剂量的增加并不 能进一步抑制CCL5的产生。而TG并未显示出剂量依赖性抑制效应，仅当浓度达到或超过60ng/ml出现比MTX更显著的抑制作用。用台盼蓝染色法，对刺激后存活细胞计数发现，不同浓度的MTX刺激后存活细胞数与单用LPS刺激并无差异。但用TG60ng/ml刺激后，当剂量达到100ng/ml，几乎所有细胞均死亡。对60ng/ml TG刺激后CCL5水平与存活细胞数的相关性关系分析结果显示，CCL5与存活细胞数呈显著性负相关（r=-0.781，P<0.05）。
3 讨论
趋化因子（Chemokine）是对白细胞起特异性趋化吸引作用的小分子细胞因子，按其N-端半胱氨酸残基的相邻位置，可将趋化因子分为四个亚类，既CXC、CC、CX3C和C趋化因子 ［4］ 。其中CXC和CC趋化因子为最常见的2个亚类，在CXC趋化因子，其N-端第一、二个半胱氨酸间相隔一个其它氨基酸（X），IL-8和生长相关基因α（GROα），他们主要对中性粒细胞起趋化作用。CC趋化因子的前2个半胱氨酸相互紧邻，这类趋化因子主要有:CCL5（又称为活化正常T细胞表达和分泌的调节因子，reguluted on activation normal t cell and secreted，RANTES），单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1，MIP-1α）和MIP-1β等，它们主要对单个核白细胞等起趋化作用。CCL5主要由T淋巴细胞产生，但最近的研究表明，大多数细胞都可表达CCL5，尤其在致炎细胞因子如IL-1β和TNF-α存在的情况下。大量的研究结果证实，CCL5在RA的关节病变过程中起极为重要的作用 ［5］ 。在RA动物模型发现，病变关节部位CCL5的表达与关节炎症及关节破坏程度相关，用CCL5的拮抗剂治疗可预防或明显减轻关节炎的发生 ［6］ 。我们发现RA患者血清和滑液中RANTES水平均显著高于OA患者，并观察到RA患者血清CCL5水平与RA的病情活动相关，同时对RA患者滑膜组织进行免疫组化染色的结果显示滑膜细胞是CCL5产生的主要部位 ［7］ 。本文体外实验的结果也证实，RA滑膜产生CCL5明显高于OA滑膜细胞。MTX一方面通过阻断DNA合成，抑制淋巴细胞增殖，另一方面通过释放腺苷，抑制淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞产生炎性介质而被广泛用于RA的治疗。TG在我国已被作为DMARD用于RA的治疗，并已证实其可抑制RA滑膜组织分泌致炎细胞因子如TNFα和IL-1 ［8］ 。我们在既往的研究中发现，在用MTX或TG治疗后，RA患者血清CCL5水平呈现下降趋势，为进一步明确MTX和TG对趋化CCL5产生的影响，我们通过体外滑膜细胞培养方法，观察MTX和TG对RA滑膜细胞产生CCL5的影响。结果发现，MTX和TG均可显著抑制LPS诱导的RA滑膜细胞分泌CCL5，但两者的作用特点明显不同。MTX剂量在5～20μg/ml范围，其抑制效应呈现剂量依赖关系，但之后随剂量的增大，其抑制作用并不能进一步增强。结果较好地解释在临床观察到的一定剂量MTX治疗后增大剂量并不能增加其疗效这种现象。对MTX处理后滑膜细胞进行形态学观察后发现，MTX对细胞活性并无影响，提示MTX可能通过干扰调节CCL5产生的信号途径如核因子κB发挥作用。对TG抑制滑膜细胞CCL5产生的作用观察结果显示，TG显示出较MTX更强的抑制CCL5产生作用。但由图2可见，其抑制效应与MTX不同，当剂量在<60ng/ml范围内，并无抑制作用，仅当浓度达到60ng/ml时出现比MTX更显著的抑制作用，之后随剂量的增大，其抑制作用并不随之增强。进一步观察发现，TG抑制CCL5产生的作用与其诱导的细胞死亡相关，表明TG主要通过细胞毒作用发挥抗趋化因子作用。
参考文献
1 Loetscher P，Moser B.Homing chemokines in rheumatoid arthritis.Arthritis Res，2002，4:233-236.
2 魏锦，胡宏，周京国，等.类风湿关节炎患者血清和关节液趋化因子RANTES的测定及其意义.中华风湿病学杂志，2002，6（4）:239-242.
3 魏锦，唐中，胡宏，等.趋化因子CCL5/RANTES在类风湿关节炎患者滑液和滑膜中的表达.中华微生物和免疫学杂志，2002，15（5）:586.
4 Arnett FC，Edworthy SM，Bloch DA，et al.The American RheumatismAssociation1987revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum，1988，31:315-324.
5 Plater-Zyberk C，Hoogewerf AJ，Proudfoot AE，et al.Effect of a CC chemokine receptor antagonist on collagen induced arthritis in DBA/1mice.Immunol Lett，1997，57:117-120.
6 Shadidi KR，Aarvak T，Henriksen JE，et al.The chemokines CCL5，CCL2and CXCL12play significant roles in the migration of Th1cells into rheumatoid synovial tissue.Scand J Immunol，2003，57:192-198.
7 Konig A，Krenn V，Toksoy A，et al.Mig，GRO alpha and RANTES messenger RNA expression in lining layer，infiltrates and different leu-cocyte populations of synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis，psoriatic arthritis and osteoarthritis.Virchows Arch，2000，436:449-458.
8 王振刚.雷公藤多甙片对健康人单个核细胞IL-6和IL-8产生的影响.中国中西医结合杂志，1997，（6）:348.
* 基金项目:四川省卫生厅科研基金资助项目（编号:010061）
作者单位:637000四川南充川北医学院风湿免疫研究所