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1 材料与方法
1.1 取材 治疗后最终死亡的10例心肌梗死患者在经患者家属同意后，由临床大夫用BARK18G活检针穿取心肌组织，将穿刺组织用生理盐水冲洗后放进10%福尔马林固定液内，以备制片用。同时取材了3例肺心衰患者和3例车祸死亡患者的心肌组织作为对照，处理同上。
1.2 组织处理
1.2.1 固定 所取得的组织用缓冲甲醇固定液在室温下固定45min。
1.2.2 脱水、透明、浸蜡、包埋 梯度酒精脱水，以70%→80%→90%→95%→无水酒精，每梯两缸，每缸20min，二甲苯透明，分两缸，每缸10min，浸蜡包埋，优质石蜡58℃～62℃两缸，每缸20in。
1.2.3 载玻片预处理 玻片浸入2%APES丙酮溶液中30秒，纯丙酮涮一下后蒸馏水洗3次，晾干备用。
1.2.4 组织切片贴片 将蜡块修理成小梯形块，置于冰箱预冷40min后在切片机上切出2～3μm的组织薄片，并将组织薄片贴到载玻片上。
1.3 免疫组化染色检测 免疫组化抗人IgG、IgM、IgA检测试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供。染色原理:以人免疫球蛋白IgG、IgM、IgA为靶抗原的鼠抗人抗体作为一抗，以生物素标记通用型二抗作为桥梁，将辣根过氧化物酶标记链酶卵白素连接在组织细胞上，最后用DAB显色。（1）石蜡切片脱蜡入水。（2）3%H 2 O 2 室温孵育10min，以去除内源性过氧化物酶。（3）PBS冲洗，2min×3次，擦干组织块周围多余的液体。（4）抗原修复:玻片浸入0.01M枸橼酸缓冲液中，微波炉上加热至95℃～98℃，并持续30min，室温冷却30min，PBS冲洗。（5）滴加封闭用正常血清，室温15min，倾去，勿洗。（6）滴加鼠抗人免疫球蛋白工作液于玻片上，37℃孵育4h。（7）PBS冲洗，2min×3次，擦干组织块周围多余的液体。（8）滴加生物素标记通用型二抗工作液于玻片上，37℃孵育15min。（9）PBS冲洗，2min×3次，擦干组织块周围多余的液体。（10）滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液于玻片上，37℃孵育15min。（11）PBS冲洗，2min×3次，擦干组织块周围多余的液体。（12）滴加新配制的DAB显色液，室温下孵育5min，显微镜下观察，适时终止显色。（13）自来水冲洗，2min×2次，然后用自来水洗，备染。（14）苏木素染色，此步染细胞核，染色时间为15min。（15）水洗同（13）。（16）盐酸酒精分色15秒。（17）水洗同13。（18）氨水30秒，促进切片蓝化。（19）脱水，以50%→70%→80%酒精，每梯两缸，每缸20min。（20）伊红染色15min。（21）脱水，以95%酒精Ⅰ1～2min→95%酒精Ⅱ1～2min→无水酒精10～15min。（22）透明，二甲苯透明，分两缸，每缸10min，确保切片完全透明。（23）中性树胶封片，切片经二甲苯透明后，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡。（24）光学显微镜下高倍观察。（25）染色结果判断:细胞核呈蓝色，胞质为红色，肌纤维和胶原纤维为红色。阳性部位呈现棕褐色颗粒。
2 结果与分析
检测结果发现:10例治疗后最终死亡的心肌梗死患者中，有3例通过免疫组化方法在细胞膜和细胞浆中检测到自身抗体的存在，均为IgG。而正常对照和非缺血性心脏病死亡者对照中无1例在心肌组织发现自身抗体（见表1）。
表1 心肌组织ACA免疫组化染色检测结果（略）可看出IgG自身抗体有结合心肌细胞的现象，IgM自身抗体未曾检出的原因是否与IgM分子量较大，不宜透过血管进入到心肌细胞有关，有待进一步研究。
3 讨论
抗心磷脂抗体是以心磷脂为靶抗原的一种自身抗体，是至今为止所知直接诱发血液高凝状态的唯一自身抗体，它可导致体内未明原因的动静脉血栓形成、心脑血管缺血性疾病、习惯性流产、血小板减少症等 ［1］ 。目前，国外国内不少学者对ACA与缺血性心脏病的发生、发展及预后进行了研究，但其结果差异很大。Harris ［2］ 等首先报道了ACA浓度升高与反复发生的动静脉血栓形成有关。随后又有研究认为其浓度的升高于心肌梗死（AMI）有关。Phadke ［3］ 等的研究却认为，ACA浓度与AMI及不稳定性心绞痛（UAP）都无明显相关性。且缺血性心脏病人血清ACA既不能帮助诊断，又无益于判断预后。而Guler ［4］ 等则报道ACA水平与AMI病人左房或右室血栓形成有明显相关性，高效价的ACA是AMI血栓形成的高危因素。国内ACA应用于心血管领域的研究仅限于对冠心病的检测，如郝素真等 ［6］ 报道血清心磷脂抗体可能影响冠心病患者的脂代谢过程。最近郭雨凡等 ［5］ 报道ACA，主要为IgG型与缺血性脑血管病密切相关，40岁以下者关系更为密切。我们的研究显示:部分缺血性心脏病的发病过程中，有自身免疫机制这一致病因素的参与，急性心梗患者尤为明显，其中大部分是ACA-IgG，这与Carrera s［7］ 等的报道是一致的。因此，我们认为，ACA可能与缺血性心脏病的发生发展有一定关系。抗心磷脂抗体导致缺血性心脏病的机制至今尚未阐明，其可能的机制有:（1）ACA于血小板膜磷脂结合，诱发免疫反应，导致血小板膜损伤;（2）ACA抑制对前列环素（Prostacycline，PGI 2 ）活性和纤维蛋白原降解，使纤溶系统激活;（3）ACA选择性的作用于血小板或血管内皮上的磷脂，抑制花生四烯酸的释放，使PGI 2 生成受抑制，从而促进了血小板的聚集;（4）ACA的IgG部分影响激活的蛋白C（PrC）活性，从而导致（PrC）抗血凝功能的缺陷，使血液处于高凝状态，促进血栓形成;（5）当凝血酶原转化为凝血酶时，需要凝血酶原激活物的激活，而ACA针对激活复合物中的磷脂发生反应，导致血栓形成。ACA的这些特征可能与血栓性疾病有关。研究表明，动脉粥样硬化早期富含胆固醇的泡沫细胞聚集，而泡沫细胞主要来自单核巨噬细胞对化学修饰的LDL（即ox-LDL）的摄入，β 2 糖蛋白（β 2 GPI）直接与ox-LDL结合形成的复合物既是ACA，而ox-LDL与心血管疾病，尤其是动脉粥样硬化性疾病密切相关。因此，由于ACA与ox-LDL有共同的抗原决定簇，故二者之间可发生交叉反应;而β 2 GPI是参与凝血的血浆蛋白，同时又是ACA在血栓形成中的协同因子，因此，ACA通过与ox-LDL的交叉反应在动脉粥样硬化和血栓之间搭起桥梁，促进血栓前状态或血栓的形成 ［8］ ;另一方面，由于ACA的靶抗原是内皮细胞、血小板、单核细胞以及肌体的天然抗凝系统 ［9］ ，故其可改变内皮细胞的正常功能，将内皮细胞的抗凝表面转化为促凝表面，同时也抑制了人体的天然抗凝系统，如组织纤溶酶原激活剂（t-PA）、血栓调节蛋白（TM）、蛋白C（PC）、抗凝酶Ⅲ（AT-Ⅲ）等，降低纤溶活性而最终导致血栓的形成。缺血性心脏病人血管内皮细胞的损伤和病变诱导产生ACA，ACA与血管内皮细胞和血小板膜上带负电荷的心磷脂发生交叉反应，抑制花生四烯酸的释放，致使前列环素合 成减少，引起血管收缩和血小板聚集，又进一步加重冠心病病人血管损伤，并使人体的凝血系统功能亢进，从而导致血栓前状态的形成。研究表明 ［10，11］ ，ACA在通过体内微循环时，可导致更多的白细胞粘附在内皮细胞表面，从而增强血管内皮细胞粘附分子（尤其是VCAM-1）的表达，造成巨噬细胞、脂质及血小板等在内皮下聚集，加速动脉粥样硬化的形成，使缺血性心脏病人的病情进一步加重。
综上所述，我们在因缺血性心脏病死亡患者的心肌组织中发现自身抗体的存在。部分缺血性心脏病的发病过程中，有自身免疫机制这一致病因素的参与，两者之间有一定的相关性，急性心梗患者尤为明显。
参考文献
1 马金栋，张言镇，李世荣，等.抗心磷脂抗体与急性心肌梗死相关性研究.中华急症医学杂志，2003，2:114-115.
2 Harris EN，Gharavi AE，Boey ML，et al.Anticardiolipid antibodies:de-tection by radio-immunoassay and association with thrombosis in sys-temic lupus erythermatosus.Lancet，1983，2:1211.
3 Phadke KV，Philips RA，Clarke DT，et al.Anticardiolipid antibodies inischamic heart disease:marker or myth.Br Heart J，1993，69:391.
4 Guler N，Bilge M，Eryonucu B，et al.Relation between left ventricular and/or left atrial thrombus and Anticardiolipid antibodies in patients with acute myocardial infarction Am J Cardio，2000，85:1391.
5 郭雨凡，赵阴环.缺血性脑血管病与ACA、IL-12及iNOSmRNA表达和关系的研究.卒中与神经疾病，2003，2:7-11.
6 郝素珍，梁瑞珍，阎鸿第，等.血清抗性磷脂抗体与冠心病相关性.中国免疫学杂志，1989，14:459-460.
7 Carreras LO，Moretti C.Lupus anticoagulant and thrombosis possible role of inhibition of prostacyclin formation，Thromb Haemostas，1982，48:38-39.
8 Koike T，antiphospholipid antibodys in arterial thrombosis.Ann Med，2000，32:127.
9 Stefanovic D，Mitrovic D，Pejnovic N，et al.The antiphospholipid syn-drome yesterday，today，tomorrow.Vojnosanit Pregl，1998，55:5.
10 Schliz AS，Lavie L，Hoecheberg I，et al.Interindividual herogenity in the hypoxic regulation of VEGF:Significance for the development of the coronary artery collateral circulation.Circulation，1999，（5）:547-552.
11 Rohan RM，Fernandez A，Udagawa I，et al.Genetic heterogenity of an-giogenesis in mice.FASEB J，2000，14（7）:871-876.
作者单位:261041山东省潍坊市人民医院检验科