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Evaluation of clinical application of gap-PCR as a routine method
forα-thalassemia carrier detection Chen Yajun，Chen Peiyuan，Xia Yuying，et al.
Women and Children's Health Care Hospital of Shaoguan City，ShaoGuan512026.
【Abstract】 Objective To evaluate the feasibility of using gap-PCR for routine screening ofα-thalassemia in clinical laboratory.Methods A total of353clinical blood samples randomly collected from the population of Shaoguan city were screened forα-thalassemia determinants with hematological and gap-PCR method respectively in a double-blind manner.Parallel analysis with Southern blot was performed to verify the genotyping results by PCR.Results Of the353samples tested，3commonα-thalassemia genes with genotypes of-- SEA /αα，-α 3.7 /ααand- α 4.2 /ααwere detected in23（6.52%），8（2.27%）and3（0.85%）cases respectively by gap-PCR，including8cases with normal phenotype and3cases of iron-deficiency anemia.The overall incidence ofα-thalassemia was9.63%in the population Shaoguan city，as determined by gap-PCR，in total agreement with the results by Southern blot.Only23of the34α-thalassemia cases were identified by hematological analysis，which had false-negative rate of32.3%.10silentα-thalassemia and1mildα-thalassemia cases failed to be detected by hematological analysis，resulting in a rate3.12%for failure of detection.Conclusion Gap-PCR method is specific and feasible as a better alternative for thalassemia screeing，especially advantageous in detecting silent carriers in comparison with hematologi-cal method.
【Key words】 α-thalassemia genetic screeing polymerase chain reaction molecular diagnosis
α-地中海贫血（简称α-地贫）是由于α-珠蛋白基因的缺陷致α-珠蛋白肽链缺如或合成不足所引起的遗传性血液病。其基因突变具有高度的异质性，主要为α-珠蛋白基因大片断缺失（缺失型），少数为碱基替代、几个核苷缺失或插入（非缺失型） ［1］ 。目前世界上已报道了至少50种不同种族人群中的缺失型α-地贫基因，中国人中有7种 ［2］ ，其中-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 为中国人最常见的α地贫突变类型。-- SEA 基因自身或与-α 3.7 （或与-α 4.2 ）基因相互组合可分别产生致死性的Hb Bart's水肿胎和严重影响生存质量的HbH ［2］ 病。鉴于我国南方人群中α-地贫基因有很高的携带率 ［3］ ，且此病尚无理想的根治方法，通过人群筛查和遗传咨询，对那些携有α-地贫基因的高风险家族实施产前诊断，是当前条件下控制α-地贫重症患儿出生的首选途径。传统α-地贫血液学筛查法是基于红细胞指数和血红蛋白电泳等多指标的综合分析法，虽可检出标准型α-地贫携带者，但却存在漏检在人群中占相当比重的静止型α-地贫的缺陷;而经典的诊断缺失型α-地贫的Southern blotting技术虽然准确、可靠，但也存在操作复杂、耗时、需使用同位素等诸多弊端，使其难以用于临床实验室的筛查工作。本室基于跨越断裂点扩增策略 ［4］ 而建立的gap-PCR方法，可简便快速检测中国人常见的3种缺失型α-地贫突变（-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 ）基因 ［5，6］ 。本文尝试将在特异性和可操作性上比较血液学分析法具有优势的这一技术，用于临床筛查α-地贫个体，以期为α-地贫的人群筛查提供新的技术选择。
1 材料与方法
1.1 研究对象 受检者为在例行婚检的韶关市户籍待婚青年共随机采集样本353例，其中男153例，女200例。
1.2 方法
1.2.1 α-地贫的筛查策略 采用血液学筛查法和gap-PCR法对样品分别进行表型和基因型分析，以双盲法进行。
1.2.2 α-地贫的表型筛查 诊断α-地贫主要依据红细胞指数和HbA 2 定量测定，辅以血清铁检查以排除缺铁性贫血。红细胞指数测定采用全自动血细胞计数仪（SWELAB AC-970，瑞典）;HbA 2 定量采用微注法（美国Helena Labo-ratories公司）。血清铁测定采用比色法进行。α-地贫表阳性样品的诊断指标为:MCV<80fl和/或MCH<27pg;HbA 2 正常<3.5%;血清铁≥10.7μmol/L。在上述MCV和/或MCH指标阳性时，若HbA 2 ≥3.5%，则诊断为β-地贫表阳性。缺铁性贫血的诊断标准见文献 ［7］ 。
1.2.3 DNA样品抽提和基因型分析 用酚-氯仿法抽外周血白细中的DNA。-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 三种基因型的检测则按第一军医大学医学遗传学教研室建立的gap-PCR方法进行 ［5，6］ 。RDB技术 ［8］ 用于β-地贫疑诊病例的基因分型。
1.2.4 Southern blot分析 从gap-PCR确定为αα/αα、-- SEA /αα、-α 3.7 /αα和-α 4.2 /αα基因型的DNA样品中分别随机抽取10、5、3和2份依文献 ［9］ 进行Southern blot分析，以佐证gap-PCR方法的可靠性。
2 结果
2.1 α-地贫表阳性检出率 在353份韶关市户籍的婚检样品中，经血液学分析检出α-地贫表型阳性样品23例，此外还检出β-地贫阳性病例11例。缺铁性贫血7例（7例均为女性），由此得出α-地贫、β-地贫和缺铁性贫血的检出率分别为6.52%、3.11%和1.98%。
2.2 gap-PCR检测结果 在上述样品中，用gap-PCR技术分别检出23、8和3例基因型为-- SEA 、-α 3.7 和-α 4.2 的α-地贫样品，由此计算该市户籍人口中此3种α-地贫的基因携带率分别为6.52%、2.27%和0.85%，人群中总的α-地贫基因携带率为9.63%。值得一提的是，有10例缺失型α-地贫样品分别发现自表型正常（7例）和缺铁性贫血样品（3例）中。余319份样品（包括11例β-地贫表型阳性的样品）未检出这3种α-地贫基因。
2.3 Southern blot分析结果 20份随机抽取的不同基因型DNA样品经Southern blot分析结果与gap-PCR法完全一致。
3 讨论
我们采取双盲法，对例行婚前医学检查的韶关市户籍人群中353份随机血样分别进行了α-地贫携带者的血液学表型和gap-PCR分子筛查。结果显示，韶关市户籍人群中α-地贫表型阳性检出率为6.52%，而gap-PCR分子筛查的阳性率为9.63%。这与最近我们完成的1006份该市户籍新生儿脐血连续样品α-地贫的分子流行病学调查结果（10.44%）完全吻合。在检出的105例α-地贫基因中，-- SEA /αα、-α 3.7 /αα及-α 4.2 /αα这3种常见的α-地贫占97.1%（结果已发表）。这说明本研究所取的样品具有较好的代表性，同时也提示本文将上述3种α-基因作为α-地贫的分子筛查对象是有临床意义的。 经基因分析确诊的34例α-地贫阳性的样品中，血液学分析只筛查出23例，假阴性11例，其假阴性率高达32.3%（11/34）。由此可看出，血液学筛查法最大的缺陷是漏诊，在本文分析的353例临床样品中，血液学方法共漏检了11例α-地贫基因携带者，故用传统血液学分析法筛查α-地贫的总漏检率为3.12%（11/353）。正如所预期的，上述漏检样品中，主要是表型为静止型α-地贫样品的贡献所致（占10/11）。众所周知，成人静止型α-地贫用传统血液学筛查法难以诊断，故本法所具有的α-地贫高特异性和灵敏性的诊断价值，主要体现在对静止型α地贫的诊断上。由于-- SEA 与-α 3.7 或-α
4.2 基因组合可能产生有严重临床后果的HbH病，为防止在以优生为目的人群筛查中由于漏检而发生不良后果，笔者建议在有条件的地区或单位，可将gap-PCR分子筛查法直接用于临床一线α-地贫的筛查。而以血液学筛查法作为主要技术手段检测α-地贫时，要特别谨慎。此外，缺铁性贫血也属于小细胞低色素贫血，当α-地贫合并缺铁性贫血时血液学指标易造成错误诊断，而α-地贫的分子筛查可对此作出准确的诊断。为了防患于未然，建议在地贫高发区对缺铁这一常见的孕妇病症，需进行α-地贫的分子诊断。本文在表型正常的样品中检出1例-- SEA 基因携带者，均属南方地区也较常见的α-地贫复合β-地贫病例，这一结果提示，α和β复合型地贫可由于α和β珠蛋白肽链合成趋于平衡而减轻异常表型，故用gap-PCR在表型正常的样品中筛查发现这类型病例是有价值的。鉴于α-地贫不象β-地贫那样有典型的血液学表型指征，需靠多项指标才能作出综合判断，且存在漏诊的问题，故本文介绍的方法在特异性和准确性上具有明显的技术优势，且证明在临床实验作为一线筛查方法是可行的。但其推广应用尚有待进一步简化DNA模板的制备和建立能同时筛查多种α-地贫基因的一管多重gap-PCR的技术。
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基金项目:本研究受广东省科委和广东省卫生厅联合攻关重大课
题基金（99B06704G）和韶关市重点科技计划项目（韶科（卫）2002-31）资助
作者单位:512026广东韶关韶关市妇幼保健院