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Comparative analysis on HBV marker results from TR-FIA and EIA detection
Wu Shumei，Zhang Lezhi，Wang Zhihua，et al.
Department of Laboratory Diagnosis，Changhai Hospital，the Second Military Medical University，Shanghai200433.
【Abstract】 Objective To investigate the reliability of TR-FIA in testing HBV marker.Methods By TR-FIA two-step quantitative analysis and EIA one-step qualitative analysis five HBV markers were detected.Con-trastively the results were analysed.Results Better uniformity between TR-FIA and EIA detection results was found，there is no significant difference between experiment and control group（P>0.05）.Conclusion TR-FIA，applied in detecting HBV marker，can insure the accuracy and stability of the outcome，and has enormous potential in the application.
【Key words】 HBV marker time-resolved fluoroimmunoassay enzyme-linked immunosorbent assay
以往检测乙型肝炎病毒（HBV）标志物五项指标（简称“二对半”）的酶联免疫吸附试验（ELISA）定性一步法，简称酶免法（EIA），以免疫化学技术为主，存在方法稳定性欠佳、检测过程中干扰因素较多和环境污染等缺陷。近年发展的时间分辨荧光免疫（TR-FIA）定量二步法测定技术具有测量灵敏度高，操作简便，干扰因素少，示踪物稳定，定量分析量程宽，无放射性污染和价格低廉等优点 ［1］ 。我们对此与EIA定量法进行了结果对比统计分析，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 450例标本，均来源于2004年8月。我院门诊和住院患者HBV标志物五项指标常规检测标本。
1.2 试剂 TR-FIA由上海新波生物技术有限公司提供。EIA由上海科华生物技术有限公司提供。
1.3 测定方法
1.3.1 TR-FIA定量二步法 HBsAg和HBeAg测定采用双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法，HBsAg采用单克隆抗-HBs包被反应板（HBeAg采用多克隆抗-HBe抗体包被反应板），当标本中有相应的抗原即与包被的单克隆抗-HBs（或多克隆抗-HBe）形成相应的复合物，再加入铕（Eu）标记物单克隆抗-HBs（或单克隆抗-HBe）抗体，即形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-DTTA-Eu（或抗HBe-HBeAg-抗-HBe-DTTA-Eu）复合物。增强液（β-NTA）将复合物上的Eu 3+ 解离到溶液中，并与增强液中的有效成分形成高荧光强度的鳌合物，其荧光强度和标本中的抗原浓度成正比。通过测定荧光强度，可知标本中的抗原含量。抗-HBs测定采用双抗原夹心、抗-HBe和抗-HBc采用中和抑制时间分辨荧光免疫分析测定，该两项除在加入标本的同时加入中和抑制剂外，其余与上三项方法相同，但其（抗-HBs除外）荧光强度和标本中的抗体浓度成反比。
1.3.2 EIA定性一步法 HBsAg和HBeAg测定采用双抗体夹心、抗-HBs测定采用双抗原夹心、抗HBe和抗HBc采用竞争法。按试剂盒说明操作。用以上两种方法同时测定450例（即每项指标各测90例）临床HBV标志物血清标本（阴性、阳性各占例数不等），统计两种方法检测结果的符合程度。
1.4 仪器 TR-FIA用Wallac公司ANYTEST2000时间分辨荧光测定仪测量结果。EIA用Ladsystems Dragon Wellscan MK3酶标仪判读结果。以上两种方法五项指标阴性、阳性判断标准按试剂盒标准要求。1.5 统计学方法 卡方检验。
2 结果
HBV标志物五项指标EIA和TRFIA结果对比统计分析P>0.05，结果见表1。
表1 EIA与TR-FIA法检测“二对半”结果（略）注: * 450例标本EIA法确认阴、阳性后，与TR-FIA一同检测
3 讨论
HBV血清标志物检测，是诊断HBV感染和分析乙肝患者病程转归的重要指标之一，特别是观察疗效，用定量的分析手段最佳。目前测定HBV血清标志物的方法有EIA法、RIA法、GI-CA法等多种方法，大多数医院应用EIA法。这些方法除RIA外，灵敏度均低，如EIA定性法的灵敏度只有1ng/ml，且实验过程受干扰因素较多，稳定性差。RIA虽可以进行定量分析，并具有较高的灵敏度，但是，由于放射性同位素半衰期短，存在放射性污染等问题，近年已应用不多。R-FIA法，可准确定量测定，其基本原理是利用镧系元素铕（Eu）标记抗原或抗体，形成免疫复合物固定于固相载体上，加入待测标本，再加入增强液后形成铕鳌合物，光照激发后在固定时间段检测特异性荧光，具有长的荧光寿命，通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光、发射荧光与激发荧光分离开来，该法本底极低，从而提高了灵敏度和精确性，其线性范围宽，灵敏度可达10 -13 mol/L～10 -18 mol/L，超过了RIA法 ［2，3］ ，更超过了EIA法，标准曲线保留时间长，受环境影响小，是目前最先进的HBV标志物诊断技术。本文检测的450例HBV标志物标本，是经过EIA法反复核实确定阴阳性后，再用TR-FIA检测，五项指标阴性、阳性结果用卡方统计学比较P值>0.05，两种方法检测结果差异不显著。因此，仅从阴阳性结果的符合程度来看，TR-FIA是一种非常稳定的检测方法，因为TR-FIA法检测抗-HBe和抗-HBc的铕标记抗体与待测抗体是同时公平竞争中和抗原，所以，假阴性、假阳性可以避免，结果准确。TR-FIA定量分析，以其突出的准确性、稳定性，无污染，价格低廉，易于存储等优点，将在HBV标志物检测中有着广泛的应用前景。
参考文献
1 Mitrunen K，Piironen T.Du-al-label one-step immunoassay for simuitaneous measurement of free and total prostate-specific antigen concentrations and ratios in serum.Clin Chem，1995，41:1115-1120.
2 袁汉尧，吕世静，黄日安，等.乙肝病毒标志物时间分辨荧光免疫测定与放射免疫测定的分析比较.数理医药学杂志，2003，16（5）:456-458.
3 秦卫仕，田蓉.时间分辨荧光免疫分析方法学评价.免疫学杂志，2002，1（5）:398.
作者单位:1200433上海第二军医大学长海医院实验诊断科
2353000福建南平解放军第92医院检验科
3200433上海第二军医大学基础部