【摘要】 目的 观察骨关节炎（OA）和类风湿关节炎（RA）患者滑液对中性粒细胞凋亡的影响。 方法 通过流式细胞仪及荧光显微镜检查19例RA和11例OA患者对体外培养粒细胞凋亡的影响。 结果 流式细胞仪及荧光显微镜检测的体外培养粒细胞自发凋亡发生率分别为43.6%和37.4%，加RA滑液组分别为18.3%和13.7%（P<0.01），加OA滑液组则分别为40.3%和31.2%（P>0.05）。 结论 RA滑液可显著降低粒细胞凋亡发生率，流式细胞仪检测凋亡较荧光显微镜检查更具敏感性。
The effect of synovial fluids from patients with rhumatoid arthritis and osteoarthritis on neutrophil apoptosis
Yang Minghui，Yuan Guohua，Wei Jin，et al.
Institute of Rheumatology and Immunology，the Affiliated Hospital of Northern Sichuan Medical College，Nanchong637000.
【Abstract】 Objective To investigate neutrophil apoptosis in the presence of synovial fluids（SF）from pa-tients with arthritis（RA）.Methods Neutrophil apoptosis was determined by flow cytometric analysis of annexin-V binding，and by terminal transferase-mediated dUTP-fluorescensin nick end-labeling（TUNEL）technique in the presence or absence of synovial fluids from19RA patients and11patients with osteoarthritis（OA）.Results In the presence of RA SF，the rate of neutrophil apoptosis was reduced from43.6%to18.3%（P<0.01）as detected by flow cytometric analysis，and from37.4%to13.7%（P<0.01）as assayed by TUNEL method.Whereas，no signifi-cant change of neutrophil apoptosis was observed in the presence of OA SF.Conclusion This study indicates that RA SF is capable of slowing the rate of neutrophil apoptosis，and that flow cytometric analysis of annexin-V binding is more sensitive than TUNEL method in detection of cell apoptosis.
【Key words】 rheumatoid arthritis apoptosis
类风湿关节炎（RA）的病理特点为大量炎性细胞在滑膜的浸润和在滑液的渗出，导致滑膜的增生、血管翳形成及软骨破坏。滑液中渗出的大量中性粒细胞释放炎性介质和蛋白酶是造成关节破坏的重要原因，而中性粒细胞在RA滑液中积聚，除与病变关节产生趋化性介质增高，吸引中性粒细胞浸入关节部位增多外 ［1］ ，还可能与中性粒细胞在滑液中的存活期延长有关。本文通过观察RA患者滑液对中性粒细胞凋亡的影响，以探讨中性粒细胞在RA滑液中积聚的机理。
1 资料与方法 1.1 一般资料 2003年6月～2004年1月在本院住院，行膝关节穿刺检查的RA患者19例，其中男6例，女13例，平均年龄（38±12）岁，平均病程（6.4±2）年。所有病人均符合1987年ACR的RA诊断标准 ［2］ ，且病情处于活动期（有一个或一个以上关节肿胀，伴血沉或C-反应蛋白升高）。患者经无菌膝关节穿刺术抽取滑液。采集的滑液在4℃，1000rpm，离心15min后，取上清液移入另一无菌试管里置-20℃保存备用。另外选择11例行膝关节穿刺、滑液检查的骨关节炎（OA）患者为对照，其中男4例，女7例，年龄（47±14）岁，平均病程（5.4±2.3）年，患者按上述方法收集滑液保存备用。
1.2 中性粒细胞培养 新鲜全血及新鲜血浆取自本院血库。中性粒细胞分离参阅文献，即取新鲜抗凝血加1/4体积的6%Dextran（分子量200kD），混匀后斜置30～45min，使红细胞下沉。取上层按1:1体积比叠加到淋巴细胞分离液上，500r/min，水平离心30min，将沉淀细胞用0.83%NH 4 Cl溶液破除红细胞。用Hank's液洗细胞3次，计数并调整细胞浓度。细胞经涂片染色分类见中性粒细胞纯度>94%，台盼蓝染色活细胞>98%。将分离的中性粒细胞悬于含10%FBS血清的RPMI1640培养液中，并使细胞浓度为2×10 6 /ml。按1ml/管接种于无菌试管，每管再加RA或OA患者的滑液1ml或加1ml正常人血浆作为自发凋亡对照组，混匀覆盖棉塞后置CO 2 （5%）孵箱于37℃培养24h，按下面方法检测中性粒细胞凋亡。
1.3 流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡 Annexin V-FITC试剂盒购自美国MBL公司。取上述培养的粒细胞悬浮液0.5ml（5×10 5 个细胞），1000rpm，在4℃离心5min，去上清后细胞沉淀用冷PBS洗2次，加500μ1结合缓冲液悬浮细胞，然后加入Annexin V-FITC5μ1，室温避光孵育5min，PBS洗后行流式细胞仪分析。
1.4 荧光显微镜检查凋亡粒细胞 通过终端转移酶介导的dUTP缺口末端标志技术（terminal transferase-mediated dUTP-fluorescensin nick end-labeling，TUNEL）检测细胞发生凋亡过程中，细胞核出现固缩，DNA链在内源性内切酶作用下裂解成的片段化DNA，凋亡原位检测试剂盒由Promega公司生产，操作按说明书进行。
1.5 统计学处理 采用U
检验比较各组细胞凋亡发生率。
2 结果
2.1 流式细胞仪分析结果 见表1。由表1可见，RA患者的滑液可显著性减少粒细胞在体外培养过程的自发性凋亡（P<0.01），而OA患者的滑液对粒细胞凋亡则无明显影响（P>0.05）。
表l RA患者和OA患者滑液对粒细胞凋亡的影响（略）
注: * P<0.01
2.2 荧光显微镜检测结果 采用TUNEL方法检测粒细胞凋亡的结果与上流式细胞仪分析结果趋势一致（见表l）。
3 讨论
细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式，它是免疫系统发育成熟和维持稳态的基础，参与T细胞胸腺内发育、自身反应性未成熟T细胞的阴性选择、靶细胞的细胞毒性杀伤以及淋巴细胞稳态的调节等 ［2］ 。细胞凋亡通过清除多余的细胞而在各种生理过程中发挥作用，同时多种疾病的发生也与细胞凋亡紊乱有关。
本文结果显示:RA患者的滑液可显著性地减少粒细胞在体外培养过程中的自发凋亡，提示RA患者的滑液中存在抗细胞凋亡物质。这一结果也可解释Hotta等 ［3］ 观察到的RA滑液中粒细胞对诱导凋亡刺激不敏感这一现象，同时说明粒细胞在RA滑液中的聚集与凋亡减少有关。
与我们观察到的结果相反，Bell等 ［4］ 发现RA患者的滑液中可能存在促进细胞凋亡的物质，可以诱导自体或异体粒细胞凋亡。造成两者观察结果不一致的原因尚不清楚，但本文结果与临床观察到的RA滑液中有大量存活的粒细胞，及与其他作者报道的组织炎性渗出液可以延缓粒细胞凋亡的结果比较相符合。
粒细胞凋亡受到多种细胞因子调节，包括致炎细胞因子，趋化因子和集落刺激因子，体外研究表明，IL-l、IL-8，生长相关基因α（GROα）及粒细胞和粒细胞巨噬细胞集落 刺激因子（G-CSF和GM-CSF）均可抑制粒细胞凋亡 ［5，6］ ，而TNFα对粒细胞凋亡则具有双向调节作用:高浓度TNFα短时间刺激诱导粒细胞凋亡，而低浓度TNFα长时间刺激则可抑制粒细胞凋亡 ［7］ ，对RA患者滑液细胞因子水平分析的研究结果也显示，上述细胞因子在RA患者滑液中的产生增多 ［8］ ，鉴于在OA滑液中仅有少数上述细胞因子产生轻度增高，而本文并未观察到OA患者滑液对粒细胞凋亡有任何作用，推测RA患者滑液抑制粒细胞凋亡的作用可能是上述细胞因子联合作用的结果。
另外，本文分别采用Annexin V结合试验和TUNEL技术，通过流式细胞仪分析及荧光显微镜检查测定粒细胞凋亡，虽然两种方法的检测结果具有高度的相关性，但经流式细胞仪分析检测的粒细胞凋亡发生率在不同组均高于荧光显微镜检查结果。其原因可能是在细胞发生凋亡的开始阶段即出现磷脂丝氨酸由细胞膜内侧向胞膜外侧转移，因而Annexin V结合试验可检测早期凋亡的细胞，而TUNEL技术则是检测片段化DNA，通常发生在凋亡过程的中晚期。由此也提示流式细胞仪分析检测细胞凋亡更具敏感性。
参考文献
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4 Bell AL，Magill MK，McKane R，et al.Human blood and synovial fluid neutrophils cultured in vitro undergo programmed cell death which is promoted by the addition of synovial fluid.Ann Rheum Dis，1995，54:910-915.
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作者单位:637000四川南充川北医学院附属医院风湿免疫研究所
作者：
杨明辉 袁国华 魏锦 郭晓兰 2005-6-16