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2 载玻片的预处理
免疫组织化学染色所用的载坡片需做防脱片处理。目前，最常用的是多聚-L-赖氨酸防脱水剂。玻片处理方法如下:首先将玻片清洗干净，用重铬酸钾清洗液浸泡洗涤玻片，再用无水酒精做脱酯处理，用自来水、蒸馏水冲洗，自然晾干，也可放在60℃烤箱中烤干。将洁净、干燥的载玻片浸泡在稀释后的多聚赖氨酸防脱水剂溶液中，浸泡时间为5min，取出烤干即可。这样处理后的载玻片在免疫组化染色中不易掉片，尤其是在微波加热修复时，并且不影响染色效果，大大减少了染色过程中掉片所造成的损失。
3 组织片的处理
石蜡切片厚4～6μm，捞片于多聚赖氨酸防脱水剂中，60℃烘烤30min～60min，再脱蜡、脱水。这个处理过程的关键是要保证梯度二甲苯和酒精的浓度，使组织脱蜡、脱水干净彻底，否则，水洗后切片含有“油珠”，呈云雾状，冲洗不干净，致使抗体在组织上分布不均，导致染色效果不佳。我科的方法是:普通常规染色所用的梯度二甲苯和酒精与免疫组织化学染色所用的梯度二甲苯和酒精分开，并且定期更换液体。在二甲苯脱蜡时，二甲苯I和II脱蜡时间不少于半小时，梯度酒精各5min左右。如在室温较低时，应将梯度二甲苯放于恒温箱中提前预热，梯度酒精时间延长，保证组织的充分脱蜡脱水。
4 组织抗原的修复
由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，使抗原性物质由于形成醛键、羧甲键等原因而被封闭了部分抗原决定簇，或者由于蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐藏，因此，在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，恢复抗原的原有空间形态。目前组织抗原的修复方法有两类，即酶消化和热修复。
4.1 酶消化法 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶，应严格掌握好消化时间、温度和浓度。胰蛋白酶使用浓度为0.05%～0.1%，消化温度为37℃，消化时间为10～40min，主要用于细胞内抗原的显示:胃蛋白酶使用浓度为0.4%，消化温度为37℃，消化时间为30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示，如:Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原蛋白）等。
4.2 热修复法 现常用微波修复、高温高压修复、水浴加热修复法。最常用的修复法是pH6.0枸橼酸缓冲液。修复过程中的注意要点是:（1）达到规定的温度（92℃～95℃以上）;（2）维持一定的时间，微波修复、水浴加热须控制在10～15min，高温高压修复须控制在2min左右;（3）避免切片干涸，如果切片干涸，抗原则可能完全丢失;（4）加热后必须经过室温自然冷却20～30min，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型。
5 切片的显色
非特异性染色的免疫组织化学检测工作中很关键的步骤之一，染色的好坏直接影响免疫组化的检测结果，主要原因有以下几点。
5.1 是否有效的祛除了内源性酶和生物素 应注意的是，并不是每一种组织均需要祛除内源性酶和生物素，但对于内源性酶和生物素含量丰富的组织如肝脏、肾脏等，如染色效果不佳，均考虑此原因。处理方法为:（1）灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/ml）加入底物液中，并保持pH值在7.6～8.2之间，即能祛除大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制;（2）饱和处理内源性生物素:消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点，具体操作是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25μg/ml亲和素溶液中处理15min，PBS清洗15min即可染色。
5.2 是否选择使用了正确的封闭血清 要消除电荷吸附所造成的非特异性背景染色，可用二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%～10%的溶液，以次溶液孵育切片，以封闭吸附位点。
5.3 所选择的抗体是否符合实验要求 因为抗原不纯，标本中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色，只能通过采用高纯度、高效价的抗体，或者针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
5.4 清洗是否充分 应严格掌握操作规程，因为在缓冲液中含有一定量的盐，这也有利于减低背景着色，通常0.05mol/L tris HCL0.15mol/L NaCl已适用于多数染色方法，溶液中加入吐温20，效果更佳。
5.5 DAB的使用是否正确 DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性;粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此须将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H 2 O。孵育时间过长也会造成背景着色。
5.6 标本染色过程中是否曾经干涸 如有干涸，会造成边缘部的非特异性染色。
5.7 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应 免疫组织化学染色的成功与否，以上几点都是关键因素，免疫组化染色过程繁琐，历时较长，这就要求每一步都要严格操作，如果掌握不好，在染色过程中会出现组织掀起、掉片、背景过深，出现假阳性、假阴性等现象，最终不能得到检测结果，如果能够严格掌握好每一步，定能做出优质切片。
5.8 其它 一抗的使用浓度是否过高。
（编辑文 静）
作者单位:255213山东淄博万杰医院病理科
（Immunohisochemistry）检测技术曾被公认为病理学发展史上的第二个里程碑，此项技术发展到今天，大大充实了病理学的内容，使病理诊断结果更精确，将病理学提高到了形态和功能相结合的水平。免疫组织化学方法的敏感性和特异性直接影响诊断结果的准确性。近两年来，在本科同志的配合下，笔者已做免疫组化420例，取得了很好的效果，并且明显的提高了诊断结果的准确性，支持了对临床病人的治疗。现提出以下五点供同道借鉴。
2 载玻片的预处理
免疫组织化学染色所用的载坡片需做防脱片处理。目前，最常用的是多聚-L-赖氨酸防脱水剂。玻片处理方法如下:首先将玻片清洗干净，用重铬酸钾清洗液浸泡洗涤玻片，再用无水酒精做脱酯处理，用自来水、蒸馏水冲洗，自然晾干，也可放在60℃烤箱中烤干。将洁净、干燥的载玻片浸泡在稀释后的多聚赖氨酸防脱水剂溶液中，浸泡时间为5min，取出烤干即可。这样处理后的载玻片在免疫组化染色中不易掉片，尤其是在微波加热修复时，并且不影响染色效果，大大减少了染色过程中掉片所造成的损失。
3 组织片的处理
石蜡切片厚4～6μm，捞片于多聚赖氨酸防脱水剂中，60℃烘烤30min～60min，再脱蜡、脱水。这个处理过程的关键是要保证梯度二甲苯和酒精的浓度，使组织脱蜡、脱水干净彻底，否则，水洗后切片含有“油珠”，呈云雾状，冲洗不干净，致使抗体在组织上分布不均，导致染色效果不佳。我科的方法是:普通常规染色所用的梯度二甲苯和酒精与免疫组织化学染色所用的梯度二甲苯和酒精分开，并且定期更换液体。在二甲苯脱蜡时，二甲苯I和II脱蜡时间不少于半小时，梯度酒精各5min左右。如在室温较低时，应将梯度二甲苯放于恒温箱中提前预热，梯度酒精时间延长，保证组织的充分脱蜡脱水。
4 组织抗原的修复
由于目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，使抗原性物质由于形成醛键、羧甲键等原因而被封闭了部分抗原决定簇，或者由于蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐藏，因此，在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，恢复抗原的原有空间形态。目前组织抗原的修复方法有两类，即酶消化和热修复。
4.1 酶消化法 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶，应严格掌握好消化时间、温度和浓度。胰蛋白酶使用浓度为0.05%～0.1%，消化温度为37℃，消化时间为10～40min，主要用于细胞内抗原的显示:胃蛋白酶使用浓度为0.4%，消化温度为37℃，消化时间为30～180min，主要用于细胞间质抗原的显示，如:Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原蛋白）等。
4.2 热修复法 现常用微波修复、高温高压修复、水浴加热修复法。最常用的修复法是pH6.0枸橼酸缓冲液。修复过程中的注意要点是:（1）达到规定的温度（92℃～95℃以上）;（2）维持一定的时间，微波修复、水浴加热须控制在10～15min，高温高压修复须控制在2min左右;（3）避免切片干涸，如果切片干涸，抗原则可能完全丢失;（4）加热后必须经过室温自然冷却20～30min，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型。
5 切片的显色
非特异性染色的免疫组织化学检测工作中很关键的步骤之一，染色的好坏直接影响免疫组化的检测结果，主要原因有以下几点。
5.1 是否有效的祛除了内源性酶和生物素 应注意的是，并不是每一种组织均需要祛除内源性酶和生物素，但对于内源性酶和生物素含量丰富的组织如肝脏、肾脏等，如染色效果不佳，均考虑此原因。处理方法为:（1）灭活碱性磷酸酶:最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/ml）加入底物液中，并保持pH值在7.6～8.2之间，即能祛除大部分内源性碱性磷酸酶，对于仍能干扰染色的酸性磷酸酶，可用50mmol/L的酒石酸抑制;（2）饱和处理内源性生物素:消除内源性生物素的方法是事先滴加亲和素以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点，具体操作是在ABC法或SP法染色前将切片浸于25μg/ml亲和素溶液中处理15min，PBS清洗15min即可染色。
5.2 是否选择使用了正确的封闭血清 要消除电荷吸附所造成的非特异性背景染色，可用二抗动物的非免疫血清，用PBS稀释为3%～10%的溶液，以次溶液孵育切片，以封闭吸附位点。
5.3 所选择的抗体是否符合实验要求 因为抗原不纯，标本中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色，只能通过采用高纯度、高效价的抗体，或者针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
5.4 清洗是否充分 应严格掌握操作规程，因为在缓冲液中含有一定量的盐，这也有利于减低背景着色，通常0.05mol/L tris HCL0.15mol/L NaCl已适用于多数染色方法，溶液中加入吐温20，效果更佳。
5.5 DAB的使用是否正确 DAB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的pH值，以确保实验结果的正确性;粉剂DAB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外DAB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此须将DAB保存于避光干燥处，现用现配，临用前加H 2 O。孵育时间过长也会造成背景着色。
5.6 标本染色过程中是否曾经干涸 如有干涸，会造成边缘部的非特异性染色。
5.7 检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应 免疫组织化学染色的成功与否，以上几点都是关键因素，免疫组化染色过程繁琐，历时较长，这就要求每一步都要严格操作，如果掌握不好，在染色过程中会出现组织掀起、掉片、背景过深，出现假阳性、假阴性等现象，最终不能得到检测结果，如果能够严格掌握好每一步，定能做出优质切片。
5.8 其它 一抗的使用浓度是否过高。
作者单位:255213山东淄博万杰医院病理科