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1 材料与方法
1.1材料 TGF-β、FN兔抗人单克隆抗体（福建迈新公司生产）。
1.2 方法
1.2.1 羊膜的取材 选取健康、无传染性疾病的剖宫产或顺产孕妇生产时的羊膜，大小为4cm×4cm，共40份。
1.2.2 分组保存 将40份羊膜无菌条件下，钝性分离出上皮面，将40份4cm×4cm大小的羊膜，分别记为A1，A2，A3……A40。
1.2.3 将40份新鲜羊膜立即于3%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋待用。将石蜡包埋片和常规石蜡切片脱蜡后，进行anti-TGF-β、anti-FN单克隆抗体免疫组织化学染色。蜡头切片，切片厚度为2μm，附于涂有多聚赖氨酸的清洁玻片上，于60℃烤箱烘30min。滴加3%过氧化氢，室温下孵育5min.甩干玻片后，用PBS充分冲洗5min，2次。滴加5%正常山羊血清封闭，室温孵育10min后，甩干玻片，滴加一抗，37℃孵育1h。PBS充分冲洗5min，3次。滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min。PBS充分冲洗5min，3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育30min。PBS充分冲洗5min，3次。滴加DAB显色剂显色。蒸馏水充分冲洗、复染、封片。
2 结果
2.1 阳性结果判断标准 TGF-β 1 的结果参照Coppola等的标准即TGF-β 1 细胞质见棕黄色颗粒，阳性细胞数0%～10%为（-）;10%～33%为（+）;33%～66%为（++）;>66%为（+++）。FN的结果标准为:细胞基底膜即细胞外基质片状或带状棕黄色染色。记录高倍镜下，100个细胞的阳性表达率。
2.2 实验结果 新鲜羊膜TGF、FN的阳性表达率都较高，分别为66.7%、65%。TGF表达于羊膜上皮细胞胞核为主，而FN表达于羊膜基质部分。
3 讨论
细胞的增殖、分化、死亡主要靠基因、细胞外基质、细胞密度等来调控。角膜为一无血液循环器官，主要靠细胞外基质、细胞因子、细胞密度调控。TGF-β是一类人体大多细胞都能分泌的细胞因子，它是一种调节细胞生长和分化的多肽。分子量为25KD、由2个分子量为12.5KD的亚基通过2个二硫键连接而成的二聚体 ［1］ 。它主要通过细胞的自分泌与旁分泌方式产生，在角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、睫状体色素上皮细胞、晶状体上皮细胞、视网膜色素上皮细胞等都能产生TGF-β且有TGF-β的Ⅰ和Ⅱ型受体表达。TGF-β的细胞学功能有很多，对细胞生长增殖作用中，它对实质细胞（淋巴细胞、上皮细胞等）起抑制作用，对间质来源细胞的增殖起促进作用。FN属于细胞外基质成分，细胞外基质作为细胞生长繁殖的底物，对干细胞的分化 繁殖也起到了调节作用。如Ⅵ和Ⅴ胶原具有维持表皮样干细胞的干细胞特性并促使干细胞集落的形成，纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）能促使干细胞与基质紧密粘连，启动一些信息调节机制，从而调节细胞的分化繁殖，如接触抑制机制的启动，缝隙蛋白、通道蛋白的表达 ［2］ 。细胞外基质是各种细胞生长时的，细胞和细胞间、细胞和组织间进行粘连、迁移和分化的媒介，它包括各型胶原、蛋白多糖、弹性蛋白、一些糖蛋白（如纤维连接蛋白fibronectin、层粘连蛋白laminin等）。细胞外基质的成分或含量发生改变，会影响细胞正常的粘连、迁移和分化 ［3］ 。羊膜在体内，直接位于胚胎的外胚层，对外胚层组织如上皮组织的分化有调节作用。现有研究表明羊膜基膜富含Ⅵ和Ⅴ胶原和FN ［4，5］ ，同时人羊膜的上皮细胞能分泌一些细胞因子如表皮生长因子、β-转化因子，成纤维细胞生长因子等。本实验证实人新鲜羊膜中TGF和FN的阳性表达率都较高，作为眼表重建修复基质，能够提供眼表上皮生长时所需要的细胞外基质、细胞因子等调节外环境。所以，人新鲜羊膜能够作为眼表重建时的生物基膜。
参考文献
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作者单位:313000浙江省湖州师范学院医学院