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流式细胞术（FCM）是利用流式细胞仪对微小生物颗粒物的多种物理、生物学特性进行定量、分析检测的技术。是当代激光、液体力学、光学和电子等学科技术高度发展的产物，是生命科学研究领域中先进的仪器之一。具有检测速度快，测量指标多，采集数据量大，分析全面，方法灵活等特点。其在肿瘤研究中已广泛应用，新试剂的不断发现使实验费用日益降低，不仅为临床提供重要的诊断依据，也使中心实验室的研究水平、实验技术提高到一个新的高度。
1 流式细胞仪工作原理
流式细胞术是近年来荧光分析技术的创举，开创了生物细胞研究的新领域。工作原理是待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，利用同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态，鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交，该区称为测量区。细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。产生的光散射信号基本上反映了细胞体积大小，细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被呈90°角方向的荧光光电倍增管和前向光电二极管接收，被积分放大后转换为电子信号输入电子信息接收器，在多道脉冲高度分析仪的荧光屏上，以一维组方图或二级点阵图及数据表或三维图形显示出，计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，实现了细胞的定量分析。流式细胞术可检测细胞的很多参数，分为结构参数和功能参数，结构参数描述细胞的形态特征和化学组成，功能参数是描述细胞的理化特性。
2 流式细胞术在肿瘤细胞凋亡中的应用
2.1 细胞凋亡的检测 按凋亡检测试剂盒Annexin V（美国PharMingen公司）说明书操作，所检测的是凋亡细胞质膜改变，正常细胞中磷脂酰丝氨酸（PS）仅存在于细胞膜内表面，在凋亡过程的早期阶段，PS发生不可逆的外翻，暴露于细胞膜外表面 ［1］ ，用一种与PS特异性结合的蛋白Annexin V（AV）可对其进行识别，再结合碘化丙锭（PI）染色可区分活细胞、凋亡细胞与坏死细胞，活细胞与凋亡细胞仍保持膜的完整性，对PI拒染，坏死细胞可被PI染色，而AV是一种大分子物质，不能透过完整的细胞膜，因而不能与活细胞结合，AV/PI双染法可以快速、灵敏地检测出细胞混合物中凋亡细胞的含量;运用流式细胞技术，还可应用TUNEL法检测细胞凋亡，其原理为发生凋亡的细胞断裂的DNA链与TdT及FITC标记的dUTP发生反应，试剂为APO-DIRECT KIT;流式细胞技术还可对凋亡细胞进行生化分析，如对Caspase酶系改变进行检测，有相关试剂盒可提供实验操作等。
2.2 线粒体膜电位的检测 细胞凋亡除存在细胞核的变化外，细胞质中的变化（主要表现为细胞器改变）也是细胞凋亡病理改变的重要组成部分，其中以线粒体的表现特别明显。线粒体内膜电位丧失，导致线粒体膜通透性的转变从而启动细胞凋亡程序，激活细胞内核酸内切酶、蛋白酶，发生细胞凋亡 ［2］ 。细胞膜电位是由于细胞膜两侧离子分布的不对称而产生的，细胞凋亡过程中常伴有线粒体膜电位下降，并且出现在核的变化之前 ［3］ ，JC-1是一种新型的亲脂性阳离子型的膜电位敏感荧光探针，正常细胞中线粒体的膜电位高，JC-1以聚集体存在，488nm激发时发出很强的红色荧光，凋亡细胞线粒体的膜电位发生去极化，红色荧光减弱，绿色荧光增强，通过红、绿荧光的比值判断线粒体膜电位的变化，从而了解线粒体在细胞凋亡中的变化。AV/PI双染法反映的是细胞膜的变化，而JC-1法反映的是线粒体膜电位的变化，细胞进入凋亡时，能量变化出现在细胞膜的变化之前，通过这两种检测方法，可以清楚的分析药物诱导的肿瘤细胞凋亡早期的情况;此外，对线粒体功能的检测还可应用荧光染料Rodamine123，这是比较常用的一种，还有DiOC6、CMXRos染料，也可用于检测。
2.3 肿瘤细胞凋亡调控蛋白的检测 Bcl-2与p53参与肿瘤细胞凋亡调控。Bcl-2过表达能抑制肿瘤细胞的凋亡。p53蛋白具有诱导肿瘤细胞凋亡作用，其他还有Bax、fas蛋白等，这些蛋白都是细胞膜内表达，均可用流式细胞仪定量检测，但除购买美国PharMingen公司的抗体外，还需要使用打孔剂和破膜剂，使蛋白细胞膜内染色，同时使用同型对照，以消除假阳性的影响，具体实验方法如下可参考说明书。
3 流式细胞术在肿瘤多药耐药研究中的应用
3.1 多药耐药基因（P-gp）表达的测定 多药耐药是肿瘤病人化疗失败的主要原因，FCM对多药耐药基因（P-gp）表达的测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。当肿瘤细胞与化疗药物接触时，脂溶性药物经浓度梯度进入细胞，而P-gp则结合药物分子，其ATP结合位点同时连上ATP，ATP的水解能将药物从胞内泵出胞外，使胞内的药物浓度不断下降，药物的抗瘤效应因此减弱甚至消失，肿瘤细胞出现耐药现象。流式细胞术可定量检测P-gp基因表达，且方法简便，可用PharMingen公司抗体直接标记检测，方法可参考说明书。
3.2 细胞内药物浓度的测定 因为MDR1耐药细胞是通过MDR基因的表达产物P-170糖蛋白的“泵”将药物泵出细胞外，所以，检测细胞内的药物浓度是一种较为准确有效方法 ［4］ ，流式细胞仪可直接测定细胞内的阿霉素荧光，且能定量，因此，在肿瘤耐药分析中，流式细胞分析是灵敏的功能性检测方法 ［5，6］ 。
4 流式细胞术检测肿瘤细胞周期
这是流式细胞术在肿瘤研究中应用最早及最具特色的领域，在培养细胞及新鲜实体瘤组织中均可应用，首先分散制备成单细胞悬液，用荧光染料染色后对细胞的DNA含量进行分析，将不易区分的群体分成三个亚群（G1期，S期和G2期），结果稳定、直观、定量。肿瘤细胞周期的流式分析已广泛应用于肿瘤的临床及基础研究的各个方面，是流式细胞技术无可比拟的优势。
4.1 肿瘤细胞DNA倍体分析 人体正常的体细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量，当人体发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随细胞DNA含量的异常改变，有资料证实，癌前病变的癌变发生率与细胞的增生程度有密切关系，增生程度越重，癌变发生率越高，随着细胞增生程度的加重，DNA非整倍体出现率增高，这是癌变的一个重要标志。FCM可精确定量DNA含 量的改变，作为诊断癌前病变发展至癌变中的一个有价值的标志，能对癌前病变的性质及发展趋势作出估价，有助于癌变的早期诊断;在常规诊断中，由于FCM分析病理细胞具有速度快，信息量大，敏感度高等优点，DNA非整倍体细胞峰的存在为肿瘤诊断提供有力依据之一，已被用在常规工作;肿瘤细胞DNA倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变中的复发率高、转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好;基础研究中，可通过对模型动物由癌前病变至癌变的DNA倍体出现率的动态追踪，判断药效，并可分析药物的作用靶点。
4.2 肿瘤细胞周期分析 FCM不仅可对恶性肿瘤DNA含量进行分析，还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案，从DNA直方图直接地看到瘤细胞的杀伤，及时选用有效的药物，对瘤细胞达到最大的杀伤效果;在基础研究中，通过对细胞周期各时相分布情况的检测，具体的分析药物作用靶点，在新药的作用机制研究中广泛应用。
总之，流式细胞技术在肿瘤研究的应用广泛，除了凋亡分析、周期分析、耐药分析外，还可定时检测肿瘤细胞内的钙浓度等其他各项指标，且结果可靠，稳定，在临床研究和基础研究中应用前景广阔，可深入至肿瘤临床的诊断、治疗、判断预后的各个领域，并应用于抗肿瘤药作用机制研究及抗肿瘤新药的开发中，为人类攻克肿瘤做出贡献。
【参考文献】
1 Engeland MV，Nieland LJW，Ramaekers FCS，et al.Annexin V-affinity saaay:A review on an apoptosis detection system based on phos-phatidylserine exposure.Cytometry，1998，31:1-9.
2 David S.Brain Research Reviews，1999，29:1.
3 Fall C，Bennetl JJ.Visualization of cyclosporion A and Ca2+ sensitive cyclical mitochondrial depolarization in cell culture.Biochim Biophys Acta，1999，1410（1）:77-84.
4 Tanaka S，Aizawa K，Katayanagi N，et al.Flow cytometric analysis of early steps in development of Adriamycin resistance in a human gastric cancer cell line.Jpn J Cancer Res，1994，85:86.
5 Chaudry PM，Roninson IB.Expression and activity of P-glycoprotein，a multidrug efflux pump，in human hematopoietic stem cells.Cell，1991，66:85.
6 Michetner EB，Roninson JB.Efficient inhibition of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance with a monoclonal antibody.Proc Natl A-cad Sci USA，1992，89:5824.
基金项目:山东省卫生厅资助课题（2001-06）
作者单位:250014山东济南，山东中医药大学
（编辑:日 强）