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【摘要】 目的 建立连翘中连翘酯苷的最佳提取和分离工艺。方法 确定提取溶剂后，以正交试验法考察加醇量、回流时间、回流次数、醇浓度4个因素及大孔树脂分离技术对连翘酯苷收率的影响。结果 连翘的最佳提取工艺为：加7倍量70%乙醇，回流提取3次，每次1.5h，大孔树脂洗脱液为40%乙醇。 结论 该工艺连翘酯苷收率为9.1%～10.6%（以药材计），连翘酯苷的含量为18.3%～22.5%，适合工业化生产。
【关键词】 连翘；提取工艺；正交试验
Extraction technology of forsythiaside from fructus forsythiae by the method of orthogonal test optimization and separation through macroporous resin
GAO Xue-min, WANG Dong,JIN Xin,et al.Department of Pharmacy, Medical College, Xiamen University, Xiamen 361005, China.
【Abstract】 Objective To design the extraction and separation technologcial conditions of forsythiaside from Fructus Forsythiae. Methods The solvent of extraction was investigated. The orthogonal test method was adopted to investigate the effect of the 4 factors, which include the concentration and volumn of alcohol, the time and the times of extraction and the process of absorption separation through macroporous resin column on the yielding rate of forsythiaside from Fructus Forsythiae. Results The optimum extraction condition were: extracting 3 times with 70% alcohol, 1.5 h each time with 7 times the volume of the alcohol. The eluent was 40% alcohol. Conclusion The results indicate that the yielding rate of forsythiaside from Fructus Forsythiae was from 9.1% to 10.6% by this technology. The concontration of forsythiaside in extract was from 18% to 22%, so this technology is suitable for industrial production.
【Key words】 fructus forsythiae;extracting process;orthogonal test
连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa (Thunb.)vahl 的干燥果实。连翘中所含成分主要为连翘酯苷(forsythiaside)［1, 2］、连翘苷(phillyrin)［3］、挥发油［4］、黄酮类等。其中，含量较高且药理活性较强的成分是连翘酯苷，其对金黄色葡萄球菌等11种细菌有极强的抑制作用，是连翘抗菌、抗病毒的主要有效成分之一［5］ 。故本文以连翘酯苷含量为指标，考察了提取溶媒。确定提取溶媒后，采用正交试验进行提取工艺优化，提取物进一步用大孔树脂分离纯化，从而系统的研究了连翘提取和分离纯化工艺。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪（616泵，996二极管阵列检测器；717自动进样器，2010色谱管理系统）；甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；水（重蒸馏水，自制）；磷酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；连翘酯苷对照品（沈阳药科大学徐绥绪教授提供）。
2 方法与结果
2.1 提取溶剂的选择 连翘中含量最高抗菌活性最大的成分为连翘酯苷，其结构中含双糖基和咖啡酰基，极性较大，在水和含水乙醇中溶解性极好。因此分别选择以水为溶媒的煎煮法和以70%乙醇为溶媒的回流提取法，比较二者优劣，含量测定结果见表1 表1 不同溶剂提取的结果结果表明：70%乙醇对连翘酯苷的提取率较水高，故选择醇提取法。
2.2 醇提取工艺优化的研究 采用正交试验法对乙醇提取工艺中的加醇量、回流时间、回流次数、醇浓度进行考察，方法与结果如下。
2.2.1 正交设计表 见表2。表2 L9（34）因素水平表
2.2.2 正交试验及结果 见表3。表3 正交试验结果
2.2.3 方差分析表 见表4。表4 方差分析表 注：F0.05 (2.2)=19，F0.01(2.2)=99
2.2.4 结果 由正交试验结果可知，回流次数和醇浓度对收率和连翘酯苷含量有极显著影响，回流时间对其有显著影响，而加醇量对结果影响很小，将其并入误差相。影响因素的显著性大小依次为C>D>B>A。最佳提取工艺为A2B2C3D2，即：加7倍量70%乙醇，回流提取3次，每次1.5h。
2.3 大孔吸附树脂的选择 最佳提取工艺获得的提取物，上样于大孔树脂柱上。试用了A型、B型、C型3种大孔吸附树脂，上样后以水洗至洗脱液无色，蒸干后固型物用聚酰胺薄膜层析检测，A型树脂吸附能力过强，B型稍有泄漏，C型泄漏严重，故选择A、B型混合使用，通过试验确定二者最佳比例。试验结果见表5。表5 大孔树脂选择结果结果表明：树脂A型和树脂B型用量比为1：1时最适宜。大孔树脂洗脱物的收率为9.1%～10.6%（以药材计），连翘酯苷的含量为18.3%～22.5%。
2.4 连翘提取物中连翘酯苷含量测定
2.4.1 标准曲线的绘制 精密称取连翘酯苷对照品1.87mg，以甲醇制成每1ml含0.187mg的溶液，作为对照品溶液。分别取对照品溶液2、4、6、8、10μl，分别进样5次，测得峰面积平均值，以进样量X（μg）为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线， Y=760201.07X-4361.40(r=0.99998)，线性范围：0.374～1.87μg。
2.4.2 样品溶液的配制 取连翘提取物5～30mg，精密称量，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀后取适量离心，上清液供HPLC法用。
2.4.3 色谱条件 色谱柱：Novapak C18柱（3.9mm×150mm）；流动相：甲醇-水-磷酸（40：60：0.1）；流速：0.8ml/min；检测波长：328nm；柱温：室温；衰减：6；进样量：5μl。
2.4.4 10批样品（大孔树脂洗脱物）含量测定 结果见表6。表6 连翘提取物中连翘酯苷
3 讨论
(1)连翘有青翘和老翘之分，据文献报道及实验测定结果知，青翘中连翘酯苷含量较老翘高，且连翘叶、连翘心、连翘壳中均含有连翘酯苷，其中连翘壳中含量最低，叶和心中含量较高［6］，故本项研究所用连翘为青翘且无需去心（种子）。
(2)连翘酯苷为连翘抗菌和抗病毒的主要成分之一，含量较高且抗菌谱广。以其作为指标能较好的反应连翘（及以连翘为主要成分的制剂）的质量和疗效。但由于连翘酯苷的对照品不易获得［7］（得到纯品难度大、稳定性较差、遇酸碱易氧化、易水解）。故现在有部分文献仍然以连翘苷来作为连翘的定量标准。
(3) 连翘为精制双黄连气雾剂中的君药，本文对连翘进行提取和分离纯化工艺的研究，为完善精制双黄连气雾剂的制备工艺奠定了基础。
(4)大孔（吸附）树脂属于功能高分子材料，在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在100～1000nm之间。 20世纪60年代末出现了合成的大孔吸附交换树脂，并于70年代末用于中草药有效成分的分离提纯。大孔树脂具有表面积较大、交换速度较快、机械强度高、抗污染能力强、热稳定好、在水溶液和非水溶液中都能使用的特点。另外成本较低，也是笔者选择大孔树脂树脂分离纯化连翘酯苷的一个重要原因。笔者试用了A型、B型、C型3种大孔吸附树脂，或是吸附能力过强，或是有泄漏，均未得到满意结果。原因可能是由于各类大孔树脂对成分的吸附特征不同，吸附量差别也很大，很难用一种树脂将连翘酯苷分离出来，故笔者采取A型、B型两种树脂联合应用，通过试验。摸索出A型、B型的最佳混合比例为1:1，在此比例下用40%乙醇洗脱能得到较满意的分离效果。
【参考文献】
1 Ming DS,Yu DQ,Yu SS. Two new caffeyol glycosides from Forsythia suspensa.J Asian Nat Prod Res,1999, 1(4):327-335.
2 宣小龙，史远刚. 中药连翘酯苷成分的提取和薄层层析检测.安徽农业科学，2006，34 (6)：1114-1116.
3 廖朝峰，胡志军，谢红亮. HPLC法测定双黄连胶囊中连翘酯苷A及连翘苷的含量.中国药师，2005，8(5)：385-386.
4 张海燕.连翘化学成分及药理活性的研究进展.中药材，2000，23（10）：657-660.
5 胡克杰，徐凯建，王跃红，等. 连翘酯苷体外抗病毒作用的实验研究.中国中医药科技，2001，8(2)：89.
6 梁文藻，傅晓勇，徐国士.连翘成分分析IV连翘酯苷的分离、鉴定和测定.药物分析杂志，1986，6(5)：263-266.
7 张立伟，杨颖.连翘酯苷稳定性研究.中成药，2003，25（5）：353-356.
作者单位：1 361005 福建厦门，厦门大学医学院药学系
2 150040 黑龙江哈尔滨，黑龙江中医药大学药学院
(编辑：汪 洋)