白癜风动物模型的研究进展

【关键词】  白癜风

    白癜风是一种常见的后天性色素脱失性皮肤病,本病主要影响美观, 给患者精神上带来巨大的压力。由于病因尚不完全清楚,目前尚无特效的根治方法。有关其病因及发病机制学说众多，有自身免疫学说、黑素细胞自身破坏学说、神经化学因子学说、黑素细胞生长因子缺乏学说、遗传因素等［1］。鉴于此，对于白癜风目前的实验中尚无针对病因制造的病理模型。但是对白癜风模型的研究仍在不断进步发展，建立一个合理的模型有助于我们攻克白癜风这一顽疾。本文对目前常用于白癜风的动物模型及模型制备方法进行综述。

    1  常用模型

    适宜的动物模型可成为研究治疗药物中有用的药理学工具，白癜风的动物模型在研究白癜风的发病机制和治疗方法上可发挥重要的作用。

    1.1  SL鸡  Smythline(SL)鸡［2,3］是人类自身免疫性白癜风的动物模型，由美国马萨诸塞州大学Smyth教授在20世纪70年代创立。SL鸡白癜风的发生是由两个相互影响的因素造成，即黑素细胞固有的缺陷和针对黑素细胞的自身免疫，最终导致黑素细胞缺失。这一模型在疾病病理的许多方面，特别是在免疫学方面与人类的白癜风极为相似。

    SL鸡最早是在一笼褐色鸡中被偶然发现的一只白色母鸡，从它翅膀上的标记看，在孵化出壳时为褐色。经过反复遗传选择实验，Smyth发现，其色素的脱失并不遵循孟德尔法则。SL鸡与它的双亲有各自不同的主要组织相容性复合物(MHC)抗原。SL鸡一般在孵化后6～12周其羽毛发生色素脱失。SL鸡可伴有不同程度的与鸟类换毛时不同的斑秃样或普秃样外观改变，酷似人类的斑秃。

    人类许多白癜风患者体内有循环抗黑素细胞抗原的自身抗体，抗体的存在与疾病的活动性和皮损面积相关。这些自身抗体能通过补体介导途径和抗体依赖的细胞毒作用破坏黑素细胞。在SL鸡模型中，SL鸡在发生色素脱失的前几周，血清中可检测到抗黑素细胞抗体，这种自身抗体可与人和鼠黑素细胞发生交叉反应。经免疫印迹法测定，这一循环自身抗体能与黑素细胞中65～80kD中的多种蛋白结合，而正常色素的Smyth鸡却没有这种抗体。已知哺乳动物的3种黑素细胞蛋白亚型即酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2均在65～80kD这一分子量范围内。经RNA印迹证实哺乳动物TRP-1是SL鸡自身抗体的主要靶抗原［4］。细胞介导的免疫反应在这一模型中也能很好的体现。SL鸡在发生色素脱失前和色素脱失的整个过程中，其新生羽毛毛囊中的T细胞浸润大量增加，αT细胞受体与βT细胞受体之比增加。在淋巴细胞浸润的早期，浸润细胞主要为CD4+T细胞，在色素脱失发生后，CD4+／CD8+比值下降，浸润细胞主要为CD8+细胞，血液中淋巴细胞无改变，但中性粒细胞在色素脱失前增加［5，6］。

    1.2  C57BL小鼠  C57BL小鼠［7～10］是由Little从Abby Lathrop小鼠近交培育而得,有C57BL /6、C57BL /6J、C57BL /10等亚系。其中C57BL /6JLer-vit/vit小鼠是C57BL /6J的同源突变系,是白癜风的鼠模型。与白癜风相关的研究主要有毛囊黑素细胞增殖与分化的调节与白癜风复色的研究以及鼠白癜风的遗传等。C57BL小鼠适合于研究毛发色素形成,以及在毛发生长过程中角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞之间的相互作用研究。如果在这一模型中加入某些干扰因素,通过组织学、生物化学、分子生物学、免疫学等技术对毛发生长状态进行研究,可直接了解皮肤黑素细胞黑素形成的能力和皮肤色素的变化情况。有人将处于毛发休止期延长期的C57BL /6J小鼠部分毛发拔除,刺激局部的毛囊从休止期进入生长期,同时在局部应用胎盘提取物,通过对毛发生长过程的观察了解胎盘提取物对黑素细胞增殖和分化的作用。其机制可能因为白癜风皮损表皮中黑素细胞消失,但局部毛囊外根鞘存在多巴阴性的黑素母细胞,通过刺激或调节这些细胞的生长、迁移和黑素生成是白癜风复色的必要条件。

    C57BL小鼠的应用范围较广，与白癜风相关的研究主要有毛黑素细胞增殖与分化的调节和白癜风复色的研究，以及鼠癜风的遗传等［2］。

    1.3  豚鼠［10～11］  远交群豚鼠，按其毛色可分为白色、黄褐色、黑色等。其中黄褐色豚鼠表皮中有适量的对UVB和PUVA敏感的功能性黑素细胞，经紫外线照射后的皮肤可产生清晰可见的色素沉着过度，表皮中多巴阳性黑素细胞数量较未照射部位增加3～4倍，黑素细胞树突增加。这一现象和过程类似于人类紫外线诱导的色素沉着，特别是黄种人的晒黑现象。因此，这一模型常用于研究紫外线诱导的色素沉着和白癜风治疗中的补骨脂素光化疗法，以及用于酪氨酸酶抑制剂和防晒剂的药效学研究。

    1.4  其他

    1.4.1  其他动物  除SL鸡外,还有白癜风狗、猫和马等动物体内有抗黑素细胞抗体,这些抗体识别的黑素细胞抗原与人类白癜风自身抗体所识别的黑素细胞抗原相似,说明动物白癜风与人类白癜风有相似的免疫反应。除C57BL小鼠和豚鼠外,还有无毛小鼠、无毛狗和无毛豚鼠等动物,表皮中均有活性黑素细胞,对环境因素的刺激敏感,在白癜风相关研究领域中也是可选择的动物模型［12］。

    1.4.2  体外试验模型［3，12，13］  有研究利用小鼠黑素瘤细胞或环切术后患者包皮制备单细胞悬液,培养传代,经DOPA染色为阳性的,证明为黑素细胞,经体外系统给药,观察药物对黑素细胞的细胞毒作用及药物对黑色素细胞增殖的影响。并观察药物对黑色素细胞中酪氨酸酶活性、黑素含量的影响,以及对黑色素细胞中酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白基因表达的影响等。

    2  常用模型制造方法

    2.1  化学脱色法

    2.1.1  过氧化氢模型  白癜风动物模型的制备国内较早期就已有报道［13］。根据黑色素不稳定、易受强氧化剂过氧化氢破坏的特性,采用5%过氧化氢外用(每次0.5ml,每天2次,脱毛区涂抹20～40天) ,使豚鼠黑色皮肤脱色,建立动物模型。测定了模型动物血液中胆碱酯酶ChE活性及Ig含量,并取用药部位皮肤进行黑色素染色,观察黑色素毛囊数及皮肤黑色素分布情况。发现用过氧化氢后,MAO明显增加, ChE活性下降, Ig明显增加,豚鼠皮肤表皮基底细胞、棘层黑色素及毛囊黑色素明显减少,用药时间越长,效果越显著,说明用过氧化氢后有模拟白癜风的作用。

    因皮肤发生局部病变后可生成过量的自由基,使生物膜脂质双层中的不饱和脂肪酸过氧化,形成脂质过氧化产物,从而使膜结构及其功能发生障碍。因此,测定过氧化脂质的代谢产物MDA含量可反映其结构和功能的变化。

    因酪氨酸酶是生物体合成黑色素的关键酶,该酶催化黑色素在黑色素细胞中合成。在合成中首先由酪氨酸转变成多巴,多巴在酪氨酸酶作用下氧化成多巴醌,多巴醌经环化成某些中间产物,最后生成黑色素。如果酪氨酸酶活性减弱,将影响黑色素的生成。据报道,白癜风患者的酪氨酸酶活性降低,血液粘稠度明显增加。因此,有人［15］利用上述化学脱色法复制的白癜风动物模型,观察了动物血液中酪氨酸酶含量及血液流变性指标的变化,发现连续50天外涂过氧化氢后,动物血中酪氨酸酶含量减少,血液流变性指标明显升高。说明用化学脱色法复制的白癜风动物模型与临床证型相一致,有代表性。另有人［16，17］利用该模型评价内服或外用中药对酪氨酸酶含量和血液流变学的影响,发现用药后不但可使模型动物黑色素毛囊数明显增多,而且可使胆碱酯酶活性恢复接近正常,使血液中酪氨酸酶含量明显增加,使血液流变性改善,提示该模型可作为评价药物治疗白癜风的模型。

    2.1.2  氢醌模型［18～20］  氢醌：氢醌又名对苯二酚。它由苯胺氧化成苯醌，再经还原而成。有人选用性质更为稳定的氢醌建立了豚鼠皮肤涂抹脱色模型。氢醌对皮肤具有脱色素作用,其机制可能是通过阻断了酪氨酸酶,使酪氨酸不转化为多巴和多巴醌,从而抑制黑色素合成,造成在形态上黑色素的表现与白癜风相似。但也有人认为,氢醌脱色实质上是一酪氨酸酶介导的细胞毒作用。氢醌分子易扩散进入黑素细胞的黑素小体,阻断黑素生成途径的一个或多个步骤,同时氢醌在酪氨酸酶作用下被氧化生成有毒性的半醌基物质,后者使细胞膜发生脂质过氧化,破坏细胞膜性结构,最终导致细胞死亡。氢醌临床上主要用于黄褐斑和炎症后色素沉着的治疗。各个国家使用的浓度不一样，从4%～8%。一般低浓度时，不良反应少，但其效果稍差，起效时间也长，浓度高时，则结果相反。氢醌应用的局部不良反应有局部刺激性、接触性皮炎、色素减退斑。色素减退一般可以复色，但有时会持久存在，特别在高浓度时更易发生［21］。

    有研究结果表明不同浓度的氢醌其脱色作用的机制可能不同,低浓度时以抑制酪氨酸酶活性为主,高浓度时主要是细胞毒作用。有人［20］利用上述模型比较评价了8-甲氧补骨脂素( 8-MOP)脂质体凝胶与其等浓度的其他剂型(酊剂、凝胶剂)对白癜风模型豚鼠的疗效,考察了各种药物对动物表皮毛囊黑色素生成、血清胆碱酯酶及皮肤丙二醛(MDA)含量等指标的变化。结果发现8-MOP各种剂型均对造模动物毛囊黑色素生成、血清胆碱酯酶及MDA含量等有明显影响,其中尤以8-MOP脂质体凝胶效果更好。本模型制作中应注意两点:一是脱毛要及时,一般3～4天脱毛1次;再者在涂药时要反复擦,尽量使之渗透,增强脱色效果。

    2.2  其他常用脱色剂［21］

    2.2.1  壬二酸  又名杜鹃花酸，是天然的直链饱和二羧酸-C9 二羧酸。1978年它从糠秕马拉色菌培养液中分离出，并认为花斑癣患者的脱色斑是由它引起的。它可选择作用于功能活跃的黑素细胞，对正常的黑素细胞影响较小。体外试验表明它能抑制酪氨酸酶活性，减少黑素的形成，并对黑素细胞的超微结构有损伤。

    2.2.2  曲酸  又名麴酸，使用浓度一般为1%-3%，其脱色机制是酪氨酸酶含有金属铜离子，曲酸能与铜离子螯合，影响酪氨酸酶活性， 从而减少黑素的合成。曲酸的脱色效果比2%氢醌差。

    2.2.3  油溶性甘草提取物P-T（LPT）及甘草根亭（liquiritin）  它们均为甘草提取物，它具有脱氧皮质酮样作用，但没有皮质类固醇的副作用。该药脱色原理：（1）甘草根亭的黄酮原子团可离解黑素分子的吡喃环；我们的体外实验研究表明：中药单体甘草酸单胺盐和18a- 甘草酸双胺盐能够抑制酪氨酸酶的活性。（2）抑制黑素的转运功能。LPT在抑制酪氨酸酶活性上比氢醌强16倍。

    2.2.4  熊果苷（arbutin）  1988年日本学者Akiu 等从杜鹃花科植物熊果的叶中分离到的具有脱色作用的单体。它是氢醌的一种天然存在形式，分子结构为氢醌-B -D- 葡萄吡喃糖苷，因它含有氢醌基团，其脱色作用可能与此有关。研究发现熊果苷能明显抑制人黑素细胞和B16鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素产生。

    2.2.5  皮质类固醇  皮质类固醇可影响细胞因子和炎症介质的产生，也可能直接作用于黑素细胞影响黑素合成。

    2.2.6  维A酸  1975年Kligam 发现痤疮患者用维A 酸治疗数月后局部皮肤颜色减退，以后应用维A酸与氢醌联合应用治疗色素增多性皮肤病取得较好的效果。维A酸脱色作用的机制可能是：（1）在体外培养B16 和S91恶性黑素瘤细胞加入维A酸，会抑制细胞黑素的形成；（2）加速表皮的更替时间，促进含有较多黑素颗粒的表皮，特别是角质层的剥脱，同时，角质层的剥脱更利于脱色药物的渗透；（3）可使黑素细胞和角质形成细胞的接触减少，黑素细胞中黑素颗粒不能及时地输送到角质形成细胞中。

    2.2.7  维生素C衍生物  维生素C通过黑素形成的多个环节抑制黑素的产生，如还原黑素中间体和黑素的聚合物，减少多巴和多巴醌类物质形成。但是维生素C在水溶液中和在热与碱性环境中能被快速氧化而失去活性，因此很难用于外用。

    2.2.8  其他可以产生脱色作用的物质  N-乙酰基-4-S-半胱胺基酚、不饱和脂肪酸、桂皮酸、没食子酸、纤维蛋白溶酶抑制剂、SOD、胎盘蛋白、蛋白多糖、蛋白激酶抑制剂、紫芝、半胱氨酸、蔷薇科植物（如樱花、大叶桂樱）的提取物、山茱萸及西洋甘菊的提取物等均有脱色之效。国外有学者还发现5-氟尿嘧啶与某些增白剂合用，能增强其脱色效果。汞剂原来一直作为常用的脱色剂，但因汞剂能引起外源性褐黄病及对肾及神经系统有较大毒性，目前已弃用。

    以上物质虽然有脱色的作用，但是并没有报道将其用于白癜风模型的制备，目前在临床用于治疗色斑、黄褐斑等。

    3  脱色法制备动物模型的应用

    龙子江等［22］采用5％氢醌对豚鼠黑色皮肤脱色，初步建立白癜风动物模型，为研究该病提供病理模型，取体重250～300g黑或黑花毛豚鼠60只，随机分成模型组和正常对照组。脱去背部黑毛5cm×8cm。模型组每天涂5％氢醌0．5ml两次，正常组涂自来水。分别于涂药后20、30和40天，各组随机选10只用20％乌拉坦麻醉，腹主动脉抽血做有关生化检测，并于用药部位中心取皮肤1cm×1cm，用中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片，用硫酸亚铁Lillie法进行黑色素染色，随意观察50个毛囊，计算其中有黑色素毛囊数。选用5％氢醌对黑或黑花毛豚鼠实验，结果表明：用5％每醌后，豚鼠皮肤黑色素减少，MAO、Clue、IgG、IgM 和IgA均升高，与临床报道相符。说明用氢醌后，使动物有模拟白癜风的作用。

    另外，龙子江等［15］还用过氧化氢脱色制备了动物模型，用于评价模型中酪氨酸酶含量及血液流变性改变，具体做法如下：取黑色或黑花色豚鼠40只，随机均分为正常组、模型组。脱去黑毛约4cm×4cm后，正常组在脱毛区涂1ml蒸馏水，每天2次；模型组涂5％过氧化氢lml，每天2次，两组连续用药50天，末次用药后40min，用乌拉坦麻醉，自腹主动脉取血。用5%过氧化氢复制白癜风动物模型,该动物血中酪氨酸酶含量明显下降,血液流变性指标明显升高,与正常组比较,有明显差异。说明用化学脱色法复制的白癜风动物模型与临床证型相一致,有代表性。在本模型制作中应注意两点：一是脱毛要及时，一般3～4天脱毛1 次；再者在涂药时要反复擦，尽量使之渗透，增强脱色效果。

    谢勇等［18］用5％过氧化氢制备白癜风动物模型，查考自制祛白酊对白癜风动物模型的治疗效果。杨淑清等［23］用氢醌脱色法制备白癜风动物模型，考察补骨脂素脂质体凝胶对黑素生成及丙二醛含量的影响。

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作者单位：830002 新疆乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区药物研究所