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【摘要】 目的 研究p53基因与bcl-2基因产物在口腔黏膜白斑组织(OLK)以及口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达。方法 用免疫组化方法检测10例正常口腔黏膜、20例口腔黏膜白斑(OLK)和20例口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中p53与bcl-2基因产物的表达。结果 p53在OLK及OSCC中的表达显著高于正常口腔黏膜，差异有显著性(P<0.05)，p53在OSCC中的表达显著高于OLK(P<0.05)。bcl-2在OLK与OSCC中的表达显著高于正常口腔黏膜(P<0.05)，在OLK与OSCC中的表达差异有显著性(P<0.05)。结论 p53基因和bcl-2基因的突变，p53蛋白与bcl-2蛋白的过度表达与口腔黏膜白斑癌变密切相关。
【关键词】 口腔黏膜白斑;鳞状细胞癌; p53;bcl-2
The expression of p53 and bcl-2 in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma
WANG Shi-guang.Tianjin Stomatological Hospital,Tianjin 300041,China
【Abstract】 Objective To observe the expression of p53 and bcl-2 in oral leukoplakia (OLK) and oral squamous cell carcinoma (OSCC). Methods The expression of proteins of p53 and bcl-2 were observed and analyzed in 10 normal oral mucosa, 20 oral leukoplakia and 20 oral aquamous cell carcinomas, by means of immunohistochemical stain methods.Results The expression of p53 in OLK and OSCC showed the higher level than in normal oral mucosa, also higher in OSCC than in OLK (P<0.05). The expression of bcl-2 in OLK and oscc is higher than in normal oral mucosa (P<0.05), the expression of stain intensity of bcl-2 in oscc is much higher than OLK,between the both had statistically significant difference(P<0.05). Conclusion p53 mutation is a key factor in the malignant transformation of oral leukoplakia and the over expression of protein of bcl-2 may play an important role in the development of oral leakoplakia.
【Key words】 oral leukoplakia; oral squamous cell carcinoma; p53; bcl-2
口腔黏膜白斑(oral leukoplakia, OLK)是指发生在口腔黏膜上，不能被诊断为其他疾病，以白色损害为主的疾病，是常见的口腔癌前病变，国内外统计约有3%～10%的白斑可以发生癌变，均恶性转化为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)。细胞恶性转化与细胞凋亡密切相关，而大量的研究均发现bcl-2和p53参与了Bax介导的细胞凋亡的调节机制。本研究采用免疫组织化学方法研究在口腔正常黏膜、白斑和口腔鳞癌组织中bcl-2和p53基因的表达，以了解二者与白斑癌变的相互关系。
1 材料与方法
1.1 标本来源 收集2004年7月—2006年7月天津市口腔医院临床病理标本，其中正常口腔黏膜(normal oral mucosa, NOM)10例，口腔黏膜白斑20例(均为异常增生)，口腔鳞状细胞癌20例(均为高分化)。所有标本均经病理确诊。
1.2 试剂和仪器 鼠抗人p53 单克隆抗体和bcl-2 单克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司，免疫组化SP试剂盒，DAB显色剂购自美国ZYMED公司，由北京中山生物技术有限公司提供。医用微波炉和Luzex-F 图像分析仪(日本日立公司) 由天津市口腔医院实验室提供。
1.3 免疫组化染色 每个标本连续切片4张，其中一张HE染色，一张作空白对照，另2张分别作p53、bcl-2免疫组化。常规脱蜡至水，行组织抗原微波修复。其余操作按免疫组化SP试剂盒步骤进行。
1.4 结果判定 显微镜下观察，p53蛋白以细胞核黄色染色为阳性指标，bcl-2以细胞浆染色为阳性指标。根据阳性细胞比例分为4级：(-)无阳性细胞，(+)阳性细胞<10%，(++)阳性细胞<20%，(+++)阳性细胞>20%。
染色强度: 采用Luzex-F 图像分析仪观察细胞染色强度, 每张切片在40倍镜下随机检测5个不相重叠视野, 以平均灰度表示染色强度, 染色强度与阳性反应强度成正比; 以阳/阴性反应区域比值表示染色范围, 染色范围与阳性反应的范围成正比。
1.5 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件包进行显著性分析。
2 结果
2.1 p53在NOM、OLK和OSCC中的表达 p53蛋白绝大多数为核阳性，仅少数出现核浆同时阳性。p53在NOM中无阳性表达;在OLK中有18例阳性表达，在上皮棘层和基底层深部可观察到突变型p53蛋白阳性细胞散在或灶性分布;在OSCC中有19例阳性表达，阳性产物集中于癌细胞核, 而癌巢间质及正常组织均为阴性。NOM和OLK及OSCC间阳性率差异有显著性(P<0.05)(见表1)。
2.2 bcl-2在NOM、OLK和OSCC中的表达 bcl-2 蛋白多为胞浆染色，细胞浆内呈现棕色。bcl-2在NOM中有1例出现阳性表达;在OL K中19例出现阳性表达，阳性细胞主要位于棘细胞层; 在20例OSCC中均为阳性。NOM、OLK及OSCC三者间阳性率差异有显著性(P<0.05)(见表2)。
2.3 p53、bcl-2的染色强度与染色范围 染色强度用灰度(x±s)表示(灰度值为0～255, 值大表示染色浅,值小表示染色深)。结果显示在OLK和OSCC中，p53蛋白与bcl-2蛋白的表达强度差异均存在显著性(P<0.05)。通过图像分析仪分析在OLK和OSCC中p53和bcl-2的染色范围, 结果显示在OL K以及OSCC中，p53和bcl-2蛋白的表达均呈正相关(γ=0.543)(见表3、4)。表1 p53蛋白在NOM、OLK及OSCC中的表达 (例)表2 bcl-2在NOM、OLK及OSCC中的表达 (例)表3 bcl-2和p53蛋白的染色强度 (x±s)表4 bcl-2和p53蛋白的染色范围 (%)
3 讨论
口腔黏膜白斑被认为是口腔黏膜常见的癌前病变。目前认为白斑癌变要经过以下几个阶段：上皮轻度异常增生、上皮中度异常增生、上皮重度异常增生[1,2]。在轻度异常增生阶段，通过药物治疗，上皮形态可以逆转为正常上皮，但是一旦发展为中重度异常增生，则无法逆转，甚至有学者认为重度异常增生就是一种原位癌。现有研究已经证实与细胞凋亡相关的p53和bcl-2在多种实体瘤中广泛表达，但其与口腔黏膜白斑癌变的关系尚需进一步研究[3]。 1979年英国皇家研究所的Lane和Crawford在进行猿猴病毒40(Simian Virus SV40)研究中发现一种存在细胞核中的蛋白，其分子量是53000，英文蛋白质字头为P，故称此蛋白为p53，正常的p53基因称为野生型p53基因(wtp53),其既是一种重要的抑癌基因，又是凋亡诱导基因[4]。它可以启动细胞凋亡来清除异常细胞，从而阻断肿瘤细胞的有丝分裂，达到抑癌作用。p53正常功能丧失最主要方式是基因突变，目前发现wtp53点突变已达3500余种[5]。wtp基因突变与人类50%肿瘤有关，其机制可能是突变型p53基因丧失与DNA结合的能力，并干扰野生型p53结合而且抑制其正常功能，细胞凋亡受阻加重，并使带有DNA损伤的细胞进入S期，最终引致细胞癌变[6，7]。正常细胞中野生型p53蛋白质易被水解，半衰期很短，难以用免疫组化法检测出来，当 p53基因发生突变导致p53蛋白过量表达时，即可用免疫组化方法进行检测 [8]。本实验p53蛋白在口腔黏膜白班和鳞癌的表达明显高于口腔黏膜正常组织(P均<0.05)，提示p53异常表达与口腔黏膜白斑恶变和鳞癌的发生有关。鳞癌中的突变型p53表达强度高于口腔黏膜白斑的表达(P<0.05)，说明突变型p53基因与口腔黏膜白斑恶变密切相关。
随着对细胞凋亡研究不断深入发现bcl-2基因家族是在细胞凋亡中有重要作用的一类蛋白质。bcl-2属于一类新的癌基因，因为它并不促进细胞增殖，但能使细胞的存活能力大大增强，即抑制细胞凋亡[9，10]。目前发现的bcl-2家族成员中,bcl-2、bcl-XL、bcl-W等可抑制细胞凋亡。与此相反，bax、bcl-XS等可促进凋亡。所有这些基因产物相互作用、形成异二聚体，两者的比例是决定细胞是否凋亡的关键。bcl-2基因同样也与肿瘤的发生发展密切相关，它是另一个大的参与细胞凋亡调控的基因家族 。最早是从B细胞淋巴瘤染色体14和18易位断裂点t(14:18)(g32:g21)中将bcl-2(B-cell lymphoma/leukema-2 即B细胞淋巴瘤/白血病基因2)基因分离出来的[11～13]。Alsabech等[14]检测了bcl-2在371例乳腺癌表达情况，阳性率高达79.3%，并且染色强度普遍很强，提示bcl-2检测对乳腺癌，尤其是转移性乳腺癌临床诊断有参考价值。Leahy等[15]检测了bcl-2在102例结肠癌的表达，阳性率22%，bcl-2在肾细胞癌检测阳性率为34.3%，多数正常的组织中bcl-2表达较低、在肿瘤组呈高表达，用PCR检测显示由于bcl-2重排导致其在结肠癌过度表达，其阳性率与肿瘤组织分化程度呈显著负相关，bcl-2高表达者预后好。但急性髓性白血病骨髓组织的bcl-2 mRNA表达越高其预后反而越差。提示bcl-2表达与病理和临床指标的关系在不同肿瘤存在一定差异。bcl-2是凋亡抑制基因，野生型p53是凋亡诱导基因，高表达的bcl-2能抑制p53诱导的细胞凋亡，说明两者之间有一定的联系。bcl-2能阻滞细胞凋亡而导致肿瘤发生的机制可能是阻断Ca2+/Mg2+的核酸内切酶活性降低;阻断凋亡基因通路而抑制凋亡，bcl-2基因还可以通过一种抗氧化剂作用或抑制氧自由基的产生抑制细胞凋亡。本试验中bcl-2基因在口腔黏膜白斑和鳞癌中的表达明显高于口腔黏膜正常组织(P<0.05)，提示bcl-2基因在口腔黏膜白斑恶变和鳞癌的发生中，使肿瘤细胞生存能力增强，导致癌症的发生。bcl-2鳞癌中的表达强度高于口腔黏膜白斑的表达(P<0.05)，说明bcl-2基因与口腔黏膜白斑恶变密切相关，很可能是通过抑制异常细胞的凋亡增加异常细胞的积累率，从而促进肿瘤的发展。
本试验通过对口腔黏膜白斑恶变组织中起着重要作用的p53和bcl-2蛋白表达的检测，发现在口腔黏膜白斑恶变和鳞癌中均呈高表达这一事实,阐述了细胞凋亡与口腔白斑恶变中的关系，对探索口腔黏膜白斑增强癌变的早期诊断、治疗和预后均可能有着重要的临床应用价值，也有利于在基因水平上对细胞凋亡的理解。本文对白斑和鳞癌中的细胞凋亡关系，仅进行了p53 和bcl-2的检测，还远不能分析其确切的关系，因此，尚须进行其他基因、有丝分裂指数、凋亡指数的检测，探讨其与细胞凋亡的关系，为早实现对肿瘤的基因治疗打下基础。
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