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【摘要】 目的 研究胺碘酮对培养的心肌细胞模拟缺血/再灌注（I/R）过程中细胞凋亡的影响与机制。方法 培养SD大鼠乳鼠心肌细胞，建立模拟I/R模型。实验分3组:（1）正常对照组;（2）模拟I/R组:缺氧2h，复氧4h;（3）胺碘酮组:I/R前加用10μmol/L胺碘酮。计算台盼蓝摄取率，测定乳酸脱氢酶（LDH）活性和心肌丙二醛（MDA）含量，以流式细胞仪（FCM）和透射电镜观察细胞凋亡。结果 在正常对照组，FCM未发现亚二倍体峰，电镜未发现凋亡细胞;I/R组FCM检测的凋亡率为（12.4±1.2）%，电镜下可见到典型的凋亡细胞，台盼蓝摄取率、LDH活性、心肌MDA含量较对照组显著增加（35.0±1.7）%vs（6.4±1.2）%，（P<0.01）;（350.2±40.4）U/ml vs（56.5±15.7）U/ml，（P<0.01）;（0.8±0.1）μmol/g vs（0.3±0.0）μmol/g，（P0.01）。胺碘酮组心肌细胞大部分存活，凋亡率显著降低（P<0.01vs I/R组），心肌MDA含量显著降低（P<0.01vs I/R组）。结论 细胞凋亡参与了心肌I/R损伤，胺碘酮能减少I/R心肌细胞的凋亡，可能与其可减轻自由基损伤有关。
关键词 心肌缺血 再灌注 凋亡 胺碘酮
Effects of amiodarone on apoptosis in cultured neonatal rat cardiomyocytes
induced by simulated ischemia-reperfusion Wang Yuying，
Wang Haichang，Zhang Rongqing，et al.
Department of Cardiology，Xijing Hospital，Fourth Military
Medical University，Xi’an，710032.
【Abstract】 Objective To examine effects of amiodarone on apoptosis in cultured neonatal rat cardiomyocytes induced by simulated ischemia-reperfusion.Methods A cell culture model of neonatal rat cardiac myocytes was used.The cultured cardiomyocytes were classified into three groups，ie，control group，simulated ischemia-reperfuˉsion group（anoxia for120min，reoxygenation for240min）and amiodarone group（10μmol/L amiodarone was added before anoxia）.The trypan blueabsorbance，LDH activity and MDA contentwere detected.Apoptosis was determined by flow cytometry（FCM）and transmission electron microscopy（TEM）.ResultsApoptosiswas not found in the conˉtrol group.After120min ofsimulated ischemia followedby240min of reperfusion，typical apoptotic cells were seen by TEM，and FCM showed an apoptosis rate of（12.4±1.2）%.While in amiodarone group，apoptosis rate was deˉcreased to only（5.6±1.0）%（P<0.01vs I/Rgroup）.Conclusion Myocardial apoptosis is involved in ischemia-reperfusion injury，and amiodarone can inhibit cardiomyocyte apoptosis induced byischemia-reperfusion.
Key words myocardial ischemia reperfusion apoptosis amiodarone
凋亡是细胞在一定的病理生理条件下发生的程序化细胞死亡。近年研究表明，凋亡是心肌细胞死亡的一种重要方式;在心肌缺血/再灌注（I/R）损伤中，细胞凋亡有着重要的病理学意义，在施行再灌注过程中应重视抗凋亡治疗 ［1～5］ 。胺碘酮（amiodarone）为广泛应用于临床的Ⅲ类抗心律失常药物，同时对心肌缺血包括各种类型的心绞痛也有良好的疗效 ［6，7］ 。本实验观察胺碘酮对心肌模拟缺血/再灌注损伤模型中细胞凋亡的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 实验动物用出生1～3天的新生SD大鼠，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供。DMEM培养基为美国GIBCO公司产品;新生小牛血清购自杭州四季青生物制品所;胰蛋白酶为Difco进口分装（1:250）;核糖核酸酶A（RNase A）和碘化丙啶（propidinmiodide，PI）购自于Sigma公司;a—肌动蛋白单克隆抗体及第二抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;胺碘酮购自杭州赛诺菲民生制药有限公司;余试剂均为市售分析纯产品。
1.2 心肌细胞培养 取大鼠乳鼠35只，无菌条件下取出心脏、剪碎，0.6g/L胰蛋白酶分次消化成单细胞悬液;离心收集沉淀，用含150ml/L小牛血清的DMEM培养液悬浮分散细胞，接种到00ml培养瓶中，CO 2 孵箱（50ml/L CO 2 、37℃）培养，90min后翻瓶。前36h内培养液中加入5-溴脱氧核苷0.1mmol/L，抑制非心肌细胞增殖。每48h换液一次，实验用第2代心肌细胞。细胞爬片后以a—肌动蛋白单克隆抗体免疫组化（SABC法）鉴定心肌细胞纯度。待心肌细胞生长至瓶底80%左右时用于实验。实验前用无血清的DMEM培养24h，使细胞周期同步化。
1.3 模拟心肌I/R模型的建立 预先用高纯氮气（999ml/L）饱和D-hank’s液40min，测血气PO 2 ≤4.0kPa;用纯氧（999ml/L）饱和Hank’s液40min。用模拟缺血溶液（缺氧、缺糖的D-Hank’s液）置换正常培养液，且于培养瓶中充入高纯氮气即缺血;再以模拟灌注溶液（含
氧和糖的Hank’s液）置换缺血溶液，开放培养瓶充以纯氧即为再灌注。
1.4 实验分组 实验随机分为3组 （1）正常对照组:正常培养6h，不予I/R处理;（2）模拟I/R组:心肌细胞缺氧2h，复氧4h;（3）胺碘酮组:先加入终浓度为10μmol/L胺碘酮，再行缺氧2h/复氧4h。各组于处理6h后收集标本，实验共重复8次。
1.5 细胞损伤的观察指标
1.5.1 台盼蓝摄取率 用1.25g/L胰蛋白酶消化分离贴壁生长的心肌细胞，制成单细胞悬液，取9滴各组细胞悬液移入试管中，加1滴4g/L台盼蓝溶液混匀;3min内用血球计数板在光镜下分别计数活细胞和死细胞（蓝染细胞）。台盼蓝摄取率=蓝染细胞/（蓝染细胞+未蓝染细胞）×100%。
1.5.2 乳酸脱氢酶（LDH）活性测定 取适量（0.2ml）培养液，日立7150全自动生化分析仪测定LDH活性。
1.5.3 心肌MDA含量测定 采用硫代巴比妥酸法。将心肌细胞研磨成匀浆，然后以3000rpm离心15min，吸取上清液置管封存冷冻。按试剂盒说明进行测定，MDA的单位是nmol/g湿重组织。
1.5.4 流式细胞仪PI染色法 用0.6g/L胰蛋白酶消化分离贴壁生长的心肌细胞，加入冷盐水—G溶液（4℃）1ml，再加入-20℃预冷的950ml/L乙醇3ml，混匀，固定、PI染色，上机检测。流式细胞仪为美国Coulter ELITEESP型。G 1 前 的亚二倍体峰即代表凋亡峰，反应心肌细胞凋亡的百分率。
1.5.5 透射电镜标本制备 用1.25g/L胰蛋白酶消化分离贴壁生长的心肌细胞，PBS清洗后，常规固定、包埋、超薄切片，铀—铅双染色，用日本JEM—2000EX型电镜观察并摄片。
1.6 统计学处理 数据以均数±标准差表示，两组间均数的比较采用非配对t检验，多组间均数的比较采用单因素多组资料的方差分析（one way ANOVA）。（P<0.05）为差异具有显著性，有统计学意义;P<0.01为差异具有非常显著性，有高度统计学意义。
2 结果
2.1 培养心肌细胞的形态学鉴定 采用上述分离方法培养的心肌细胞，接种约6h开始贴壁生长，培养至48h后细胞成单层，呈现有规律的同步搏动，结合a-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色（SABC法），纯度达90%以上。
2.2 I/R后心肌细胞损伤观察
2.2.1 台盼蓝摄取率 对照组心肌细胞台盼蓝摄取率为（6.4±1.2）%;I/R组台盼蓝摄取率显著增加（P<0.01vs对照组）;胺碘酮组台盼蓝摄取率较I/R组显著降低（P<0.01），见表1。
表1 各组心肌细胞的台盼蓝摄取率、LDH活性、MDA含量及细胞凋亡率（略）注:与对照组比较， a P<0.05， b P<0.01;与I/R组比较， c P<0.012.
2.2 LDH活性变化 与对照组相比，I/R组LDH活性显著增加（P<0.01）;胺碘酮组LDH活性
与I/R组相比显著降低（P<0.01），见表1。
2.2.3 MDA含量变化 与对照组相比，I/R组MDA含量显著增加（P<0.01）;胺碘酮组MDA含量与I/R组相比显 著降低（P<0.01），见表1。
2.2.4 流式细胞检测细胞凋亡率 对照组未见亚二倍体峰;I/R组在G 1 期前出现明显的亚二倍体峰，凋亡率均为12.4%;而胺碘酮组细胞凋亡率较I/R组明显降低（P<0.01），见表1，图1。图1 流式细胞仪检测的细胞凋亡率（从左至右依次为对照组、I/R组、胺碘酮组;图中横轴代表DNA含量，纵轴代表细胞数）
2.2.5 透射电镜观察 正常对照组心肌细胞超微结构清晰。I/R组除坏死细胞外，可见较多细胞浆浓集、胞体变小变圆、胞核染色体集中于核膜周边呈新月型而胞膜完整的凋亡细胞。而胺碘酮组大部分细胞结构清晰，线粒体无变化，仅少数有线粒体空泡变性、内质网扩张，但异染色质均匀。
3 讨论
长期以来认为坏死是心肌I/R时细胞的唯一死亡方式。随着对I/R损伤机制的深入研究，近年来逐渐认识到心肌细胞死亡有