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【摘要】 目的 探讨海南岛黎族不同支系在2个Y-DNA基因座的遗传多态与差异。方法 采用PCR扩增DYS199、Y-27H39基因座，琼脂糖凝胶电泳及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。结果 黎族3个支系289个男性个体的DYS199位点均未发生突变，全部为C。但在Y染色体特异性微卫星Y-27H39基因座发现4种等位基因，等位基因频率分布，在3个支系中均以194bp的频率为最高，分别是0.711、0.855和0.667。统计分析显示:杞黎与 亻 孝 黎人群在DYS19位点的等位基因频率差异有极显著性（P<0.01）。本地黎与杞黎差异无显著性。结论 本研究为我国人群Y染色体特异性SNP和STR的群体遗传学、法医学研究提供了可比性资料，对搞清海南岛黎族的起源及进化研究有较大的意义。
关键词 黎族 Y染色体多态 DYS199 Y-27H39
Polymorphism analysis for DYS199，Y-27H39 of three Li populations in Hainan Island
Li Dongna，Chen Lu，Zhou Zhenjian，et al.
Department of Biology，Hainan Medical College，Haikou571101.
【Abstract】 Objective To study the genetic polymorphism and population diversity of two Y-DNA loci in Li ethnic groups in Hainan Island. Methods DYS199、Y-27H39 loci were amplified and were analyzed by agarose gel electrophoresis and denatured polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining. Results We found that all of the 289 samples chosen from three groups of Li ethnic populations had DYS199C alleles. The polymorphism of the Y-27H39 loci was investigated also in three Li populations. The results shows that four alleles were observed for Y-27H39（190bp、194bp、198bp、202bp designated as alleles B、C、D、E respectively），the allele C，frequency of which range from 0.660～0.854，is predominant in three Li subgroups. The pairwise comparison with Fisher’s Exact test reveals that there exists significant difference（P<0.01）in Y-27H39 phenotype distribution between Qi Li and Ha Li populations. Conclusion The preliminary study indicates a reference population for detecting male migration events and should be useful in population genetic and forensic applications.
Key words Li ethnic Y-chromosome polymorphism DYS199 Y-27H39
人类Y染色体除拟常染色体区外，大部分在遗传过程中不发生重组，这些非重组部分将以单倍型的形式遗传给儿子，为男性所特有。因此，对于Y染色体非重组部分的DNA多态性研究，不仅可以追溯过去发生的男性迁移，重构父系进化史，而且在法医学研究中也占有重要地位 ［1，2］ 。黎族是中华民族的重要成员，是海南岛特有的少数民族。语言属汉藏语系壮侗语族黎语支。根据方言、生活习惯、文化特征以及人种学上的差异，又分为: 亻 孝 黎、杞黎、本地黎、美孚黎和加茂黎5个亚群 ［3］ 。为探索DYS199、Y-27H39各等位基因频率在中国海南岛黎族不同支系的分布，我们对海南岛黎族的3个支系共289人进行了筛查。
1 材料与方法
1.1 样品 根据“知情同意”原则，分别从海南岛黎族3个支系的主要居住地区（表1），随机选择4代均为同一黎族支系的无亲缘关系的男性个体为研究对象，每个个体抽取静脉血2～3ml。
1.2 引物序列 Y-27H39.15′-CAT CTG AGT TTC TGT TATAGT-3′;Y-27H39.25′-ATG GCA TGT AGT GAG GAC A-3′;DYS199F5′-TAATCA GTC TCC TCC CAG CA-3′;DYS199R/C5′-GGT ACC AGC TCT TCC TAA TTG-3′;DYS199R/T5′-GGT ACC AGC TCTTCC TAA TTA-3′;
1.3 基因组DNA提取 按常规酚氯仿法 ［4］ 提取基因组DNA。
1.4 DYS199的PCR扩增与基因型检测 PCR扩增基本按Underhill等人的方法 ［5］ 并稍加改进。12.5μl反应体系含:50ng基因组DNA，引物各5μmol/L，dNTP各0.2mmol/L，1.5mmol/LMgCl2 ，10mmol/LTris-HCl（pH8.3），0.5UTaq DNA聚合酶。样品在94℃变性2min，然后35周期循环:94℃20s变性，60℃30s退火，72℃60s延伸，最后，72℃继续延伸5min。PCR扩增结束后，2%琼脂糖凝胶（离子强度1×TBE）电泳，100V恒电泳30min，用凝胶自动分析和成像系统电泳检测扩增结果。
1.5 Y-27H39基因座的PCR扩增与基因型的检测 PCR扩增按Roewer等人 ［6］ 的方法进行。25μl反应体系含:50～100ng基因组DNA，0.12μmol/L，DNTP各0.2mmol/L，3mmol/LMgCl2，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl（pH8.3），0.5U Taq DNA聚合酶。反应条件:95℃变性5min，然后30周期循环:94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min。最后72℃延伸10min。按Santos等的方法 ［4］ 在10%的变性聚丙烯酰胺凝胶（含8mol/L尿素，交联比29:1）上，PCR扩增产物，以500V电泳4h。电泳结后揭胶并银染，显示电泳分离片段。
2 结果
2.1 DYS199多态性分析结果 经检测，黎族3个支系289个男性个体的DYS199位点均未发生突变，全部为C，见图1，表1。
表1 DYS19和DYS287基因座等位基因频率在本地黎、杞黎、 亻 孝 黎人群中的多态分布（略）
2.2 Y-27H39基因座多态分析结果 中国海南岛黎族3个人群中Y-27H39各等位基因频率见表1，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染着色结果见图2，显示了本研究在黎族3个人群中所观察到的4种表型，即B（190bp）、C（194bp）、D（198bp）、E（202bp）。
3 讨论
研究群体中Y染色体非重组部分DNA多态性，可以追溯过去发生的男性迁移、对重构父系进化史有重要意义。近年来，许多关于Y-DNA多态的分析已为阐明现代人类群体间的进化关系提供了越来越多的分子生物学证据。为此，Y-DNA多态在群体遗传学研究中的价值正日益受到人们的重视 ［2］ 。
DYS199是Y染色体非重组部分因发生单碱基C→T的突变形成的多态位点。在调查现代人起源与迁徙历史的研究中，被认为是一个非常有价值的Y-DNA标记。DYS199位点多态分布在世界范围内显示出明显的人种与地域差异。到目前为止调查显示，DYS199T等位基因只在美国土著人群表现出较高的频率（平均为61%），一些遗传学家根据考古学确认的“美国土著人群起源于亚洲的假设”，认为有必要扩大对亚洲人群的T等位基因的筛查 ［7］ 。但目前在美洲以外所调查人群的结果显示，只有亚洲的西伯利亚Eskimos、Chukchi、Even人群发现T等位基因，其余地区的人群均为C等位基因。Underhill等人根据DYS199与DYS19连锁分析，估计出DYS199基因座C→T的突变发生在大约30000年以前 ［5］ 。Jeffrey等人由此推测美洲土著人群DYS199基因座存在的C→T的突变是在他们离开亚洲到达白令大陆后发生的。从我们对海南岛3个黎族支系的筛查结果显示，本地黎、杞黎、 亻 孝 黎的289个男性个体均未发生C→T的突变，即均为C等位基因。这种结果支持Jeffrey等人的结论与推测。
对Y-27H39微卫星基因座多态性在海南岛3个黎族支系本地黎、杞黎、 亻 孝 黎3个群体中分布状况调查结果表明，等位基因C（194bp）在3个黎族支系中频率最高。其中 本地黎和杞黎的C等位基因频率甚至高于亚洲泰国人群（0.69） ［9］ ，分别达到0.711和0.855，C等位基因频率相对较低的 亻 孝 黎也达到0.667。但在3个黎族支系中均未见到A型和F型等位基因，而且杞黎未见到E型， 亻 孝 黎未见到B型等位基因。经Fisher检验显示:在Y-27H39基因座，本地黎与杞黎，本地黎与 亻 孝 黎之间无明显差异（P>0.05），但杞黎与 亻 孝 黎差异有极显著性（P<0.01）。3个黎族支系与白种人、黑人、美国印地安人、亚洲人以及中国的汉族、壮族等两两比较也均显示差异有极其显著性（P<0.001）。黎族群体与其他民族的这种差异可能是因为海南岛黎族群体有一个有限数量的建立者，而且在历史上由于地理上的特殊位置，导致其有相当长的一段时间与外界隔绝，所以形成了海南岛黎族群体特殊的遗传特征。而杞黎与 亻 孝黎的不同可能与杞黎群体在历史上经过遗传漂变，而 亻 孝 黎群体可能与其他群体有基因交流有关。这一推测已通过我们对另外Y-DNA基因座的检测与分析得到进一步的证实（有关内容另文发表）。
Y-27H39微卫星基因座的多态性分布在世界范围内表现出较强的人群特异性，美国印地安人以A型为主，而欧洲人以B型占优势，亚洲和非洲人群则以C型为主，即使在同一地理区域的不同人群，主要等位基因型的分布频率也是不同的 ［10］ 。越是处于大陆边缘和地理位置相对隔绝的地区生活的民族较那些地处大陆中央的民族更易保存其群体的等位基因频率。在中国人群中，等位基因C是其主要等位基因 ［11，12］ 。本文调查的是地处中国最南端的最大岛屿—海南岛居住的3个黎族支系的人群，他们与中国的藏族一样，在Y-27H39位点C型等位基因表现出较高的分布频率达60%以上，这与前人对DYS19基因座的多态性分布特点研究的结论是一致的。
黎族Y-27H39微卫星基因座多态性与其他人种、民族的差异性，提示若进一步积累其他民族的相关资料和使用多种遗传标记系统对黎族不同支系进行深入研究，便有可能从分子水平揭示黎族不同支系之间乃至与其他民族之间的亲缘关系。本研究获得了DYS199基因座和Y-27H39微卫星基因座在海南岛黎族3个支系的多态性分布数据，为法医学鉴定、遗传学分析以及人类进化研究提供了可比性资料，对搞清海南岛黎族亚系之间的遗传关系及其起源可能会有较大的意义。
（本文图见附页1）（略）
参考文献
1 Foster E A，Jobling MA，Taylor PG，et al. Jefferson fatheredslave’s last child. Nature，1998，396（6706）:27-28.
2 Stumpf MP，Goldstein D B.Genealogical and evolutionary inference with the human Y chromosome. Sci