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关键词 中脑神经前体细胞 胎龄 诱导分化
In vitro culture and induced differentiation of ventral mesencephalic precursors from rat embryos at different embryonic stages
Gong Zhigang，Huang Qiang，Lan Qing
Department of Neurosurgery，Second Affiliated Hospital of SoochowUniversity，Suzhou215004.
【Abstract】 Objective Ventral mesencephalic precursors from rat embryos at different embryonic stages were expanded in vitro and were induced to differentiate into dopaminergic neurons（DNs）which determined the optimal research material for the subsequent study on large-scale cell transplantation as a treatment of Parkinson’s Disease. Methods Ventral mesencephalic dopaminergic precursors from rat embryos at different embryonic stages（from E10 to E14）proliferated with bFGF for 7 days and differentiated for the next 7 days in the special differentiation medium containing L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt（AA-2P）. The yields of DNs were detected and compared by means of immunofluorescence staining. Results The total cell numbers in E10，E11，E12，E13 and E14 cultures increased about 76.39 times，59.67 times，51.85 times，14.35 times and 10.31 times，respectively. The ratio of DNs versus the total cell population in E11，E10 and E12 cultrues decreased sequentially and significantly，but all of them were significantly higher than those in E13 and E14 cultures. The ratio of DNs versus all the neurons in E11 culture was significantly higher than those in E10 and E12 cultures，while the latter two were higher than those in E13 and E14 cultures significantly. Conclusion Ventral mesencephalic dopaminergic precursors from E11 rat embryos with the crown-rump length of 5～6mm are the optimal research material，which can in vitro supply enormous cell resources for the study of cell transplantation.
Key words mesencephalon neural precursor embryonic stage induced differentiation
帕金森病是一种中老年常见的神经系统变性疾病，病理上主要是黑质中多巴胺能神经元（dopaminergic neuron，DN）变性缺失，移植健康的DN可能是一个较好的治疗方法。事实上，移植富含DN的胚胎组织，无论在动物模型上还是在临床试验中均已取得了较为肯定的疗效。只是由于需移植6至7个人胚胎中脑组织才能提供足够数量的DN给1个PD病人 ［1］ ，因此该治疗的推广应用受到了极大地限制。胚胎腹侧中脑组织中除了成熟的神经元外还含有较多的神经前体细胞（neural precursor），它是神经干细胞和祖细胞的统称 ［2］ 。这种细胞具有较强的分裂、增殖能力。如在体外用人工方法扩增培养并诱导其分化，就能得到较多的DN，可为帕金森病的细胞移植治疗提供较为充足的细胞资源。但是，究竟哪个发育阶段的胚胎中脑神经前体细胞经取材培养后能产生数量较多并且发育成熟的DN，国内外尚无定论。为此我们系统地进行体外培养来自不同胎龄的胎鼠腹侧中脑神经前体细胞，诱导分化后比较DN形成情况，据此决定出最佳培养对象，为今后大规模细胞移植试验奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 SD孕鼠（300g左右）、氯胺酮（Essex公司）和Rompun（Bayer公司）、层粘连蛋白（BD Biosciences公司）、纤维粘连蛋白（Invitrogen公司）、多克隆免抗鼠β-TubulinⅢ（Covanle公司）、抗-小鼠Cy3（Dianova公司）、山羊抗兔Alexa488（Molecular probes公司）、山羊血清（PAA公司）。此外，DMEM粉末、F12粉末、B27添加剂、N2添加剂、L-谷氨酰胺、Neurobasal、台酚蓝、碳酸氢钠均购自Gibco公司。L-抗坏血酸2-磷酸酯倍半镁盐（L-ascorbic acid-2-hposphate sesquimagnsium salt，AA-2P）、多聚甲醛、DNase、bFGF、DAPI、Triton-x-100、小鼠抗TH-2均为Sigma公司产品。
1.2 方法 将孕14天的孕鼠腹腔注射氯胺酮（0.1ml/100g体重）和Rompun（0.025ml/100g体重）麻醉后剖腹，游离暗红色串珠样的“V”字形双子宫。取出胚胎，挑选冠臀长（crown-rump length，CRL）为11～12mm的胚胎。在Leica解剖显微镜下分离腹侧中脑组织，汇集后反复吹打，形成单细胞悬液。200g离心5min后重新吹打混匀。台酚蓝计数后以7×10 3 细胞/cm 2 的密度接种于预涂以层粘连蛋白和纤维粘连蛋白的48孔培养板内培养，使用扩增培养基（DMEM/F122:1、2g/L碳酸氢钠、1%N2、20ng/ml bFGF），隔日换液。在第8天改用分化培养基（Neurobasal中加入1%L-谷氨酰胺、2%B27、1%胎牛血清和100μMAA-2P）。依旧隔日换液，连续培养7天。弃培养液，加入4%多聚甲醛，30min后用PBS冲洗，加入4%山羊血清和0.1%Triton-x-100液，静置30min。换为相应一抗和0.1%Triton-x-100液，4℃过夜。一抗用小鼠抗TH-2（1:10000）和免抗β-TubulinⅢ（1:1500）。清洗后加入4%山羊血清、DAPI（1:10000）和相应二抗:抗小鼠-Cy3（1:200）和抗兔-Alexa488（1:150）.室温下放置1h，PBS冲洗后在Zeiss荧光显微镜下观察染色情况。每种染色细胞均计数12个培养孔，每个培养孔均随机计数10个区域，计算染色细胞的数目。
胎龄10天、11天、12天和13天的胚胎腹侧中脑神经前体细胞的取材、培养、染色、计数等方法均类似，只是相应地需取材孕10天、11天、12天和13天的大鼠，所挑选的胚胎CRL分别为3～4mm、5～6mm、7～8mm和9～10mm。
2 结果
细胞接种后一般很快贴壁，伸出1～2条短小突起，呈逗点状。在扩增培养基作用下多数细胞生长受抑，只有神经前体细胞数目进行性增多，形成小簇，簇内细胞以多角形为主，四周则以细长形为主，胞体小而圆，有细长的纤维状突起向外延伸，小簇渐形成大簇。大约5～6天时，呈暴发性生长，细胞向外扩散迁徙明显，平铺成一大片。第8天加入分化培养基后，细胞生长似乎略有停滞。第9～10天细胞生长又渐旺盛起来，似乎适应了新的培养液。第11天左右再次呈现爆发性生长，细胞再次向外扩散迁徙明显，向外平铺成更大的一片。随后细胞增长减缓，一些细胞渐呈出现明显的神经元样形态，很多纤维状突起交织在一起，形成网络状结构。免疫荧光染色可见到各种细胞的细胞核（DAPI着染）、各种神经元（均β-TubulinⅢ阳性）以及DN（TH阳性）。需要指出的是，从E10到E14，细胞增殖能力进行性下降，细胞密度进行性降低。在E10细胞体系中，β-TubulinⅢ阳性神经元极多，密集分布，其中TH阳性神经元较多，成团簇状。在E11细胞体系中，β-TubulinⅢ阳性神经元也是多而密集，TH阳性神经元较多，密集拥挤成大片。在E12细胞体系中，β-TubulinⅢ阳性神经元较少而松散，TH阳性神经元较少，交织成散在小片。在E13细胞体系中，β-TubulinⅢ阳性神经元明显少而散在，TH阳性神经元更是散在分布。在E14细胞体系中，β-TubulinⅢ阳性神经元聚集成致密小球形，纤维向四周放射状延伸，而TH阳性神经元极少。
细胞计数发现E10、E11、E12、E13、E14细胞培养后最终得到的细胞总数分别为（5.13±3.17）×10 5 、（4.01±1.84） ×10 5 、（3.48±1.13）×10 5 、（0.96±0.90）×10 5 、（0.69±0.47）×10 5 ，分别较接种时增加约76.39倍、59.67倍、51.85倍、14.35倍、10.31倍，经Nemenyi法秩和检验证实E10、E11和E12均显著高于E13和E14（P<0.05，n=24），此外E10显著高于E12（P<0.05，n=24）（见图1）。对于TH + 细胞占所有细胞的比例，同样经Nemenyi法证实，E11、E10、E12依次显著降低（P<0.05，n=12），并且均显著高于E13和E14（P<0.05，n=12）（见图2）。对于TH + 细胞占β-Tubulin + 细胞的比例，Nemenyi法证实，E11显著高于E10和E12（P<0.05，n=12），而后两者均显著高于E13和E14（P<0.05，n=12）（见图3）。
3 讨论
胎鼠腹侧中脑组织中神经上皮细胞形成DN的时间跨度大约为5天，从E11到E15，在E15时DN发育成熟，黑质基本形成 ［3］ 。在E12.5时多巴胺合成的特异性限速酶酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）染色开始出现阳性，说明此时中脑DN开始形成，因此很多学者均以E12中脑细胞作为研究对象 ［4～6］ 。我们认为胎龄越小，前体细胞增殖能力越强，将来分化成的DN可能会越多，因此我们先后尝试解剖了E11胚胎和E10胚胎。至于更小的胚胎，例如E9只有2mm左右大小，中脑的解剖标志尚不明显，仍是很细的神经管，难以正确判断解剖位置，因此未能取材。E15胚胎的DN已发育成熟，显然不适合用于研究神经前体细胞。故我们重点针对E10～E14胎鼠腹侧中脑神经前体细胞进行系列研究。
不同的学者对胎龄的定义不完全相同。有人认为雌鼠夜间交配后次日发现有阴栓存在时，即为E0 ［7］ ;也有人认为此时应定