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1 材料与方法
1.1 标本 随机选择RA患者22例，RA诊断根据1987年美国风湿病学会（ACR）修订标准 ［3］ ，其中活动期13例，非活动期9例;病程1个月～10年，另设健康对照20例为对照组，分别取RA患者和正常人静脉血10ml。
1.2 PBMC的分离和培养 用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法分离和培养PBMC，含10%胎牛血清的RPMI1640培养液重悬PBMC，调细胞浓度为10 6 /ml，在24孔培养板内每孔加1ml细胞悬液，PMA10ng/ml，离子霉素1μmol/L，莫能霉素3μmol/L，37℃，5%CO 2 恒温培养箱培养5h。
1.3 细胞内细胞因子的染色 ［4］ 收集培养细胞，PBS液洗2次，每管加PBMC悬液（含2～3×10 6 细胞），加入固定剂100μl振荡均匀后，放置室温下固定15min。固定结束后，每管中加入3ml PBS，以1500rpm离心10min。去上清，制成细胞悬液。加入CD4-FITC单克隆抗体，振荡均匀，在室温避光处孵育20min。孵育结束后，加1ml PBS，以1500rpm，10min洗涤。去上清，加入100μl破膜剂和10μl Anti-γ-IFN-PE，轻轻振荡均匀后，在室温避光处孵育20min。孵育结束后，加入3ml PBS，以1500rpm离心10min，去上清，加入500μl PBS重悬后，可上机检测，同型对照为IgGl-FITC。Anti-IL-4-PE及同型对照的标记重复步骤同上，对照组和实验组的标记过程相同。
1.4 流式细胞仪分析 流式细胞仪为美国BD公司FacˉsCalibur型。
1.5 抗体和试剂 CD4-FITC标记单克隆抗体（鼠抗人的IgG1）IL-4-PE标记单克隆抗体（鼠抗人的IgG1）γ-IFN-PE标记单克隆抗体（鼠抗人的IgG1），鼠IgG1-FITC，均为法国Immunotech公司产品。细胞破膜试剂盒（Caltag公司:GAS-003;包括细胞固定剂和破膜剂）。PMA、离子霉素、莫能霉素、二甲基亚砜均为美国Sigma公司产品。RPMI1640培养基、胎牛血清均为Gibco公司产品。
1.6 统计学处理 结果以均数±标准差（X±s）表示，实验数据用SPSS11.0统计软件进行t检验，P<0.05认为差异有显著性。
2 结果
2.1 RA患者PBMC刺激前后细胞内细胞因子的表达 RA患者PBMC及正常人PBMC经PMA/离子霉素和莫能霉素刺激培养5h后均能测出细胞内IFN-γ/IL-4阳性细胞，而不加刺激培养则细胞内细胞因子染色阴性。活动期RA患者PBMC经刺激培养后测到的细胞内IFN-γ/IL-4阳性细胞明显高于非活动期RA患者。
2.2 RA患者PBMC表达细胞内细胞因子的流式分析 用流式细胞仪检测了22例RA患者PBMC刺激培养5h后，细胞内细胞因子IFN-γ/IL-4的表达情况，与正常人相比，RA患者PBMC中的IFN-γ阳性细胞百分率（Th1）和IFN-γ/IL-4阳性细胞百分率（Th0）明显增高（见表1）。13例活动期RA患者的PBMC中的IFN-γ/IL-4和IFN-γ阳性细胞百分率明显高于9例非活动期RA患者，而IL-4阳性细胞百分率明显降低（见表2）。
表1 RA患者PBMC中的IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4阳性细胞的百分率（略）
注: ˇ P<0.05
表2 活动期和非活动期RA患者PBMC中的IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4阳性细胞的百分率（略）
注: ˇ P<0.05
3 讨论
近年来，运用荧光标记抗细胞表面抗原和抗细胞内细胞因子单抗，结合短时间固定、破膜打孔处理技术，使检测细胞内细胞因子成为可能 ［5］ 。流式细胞分析术检测细胞内细胞因子的方法已在RA中得到广泛的应用。正常人的Th1/Th2型细胞因子处于平衡状态，而类风湿性关节炎（RA）是一种器官特异性的自身免疫病，促炎性的Th1及其细胞因子IFN-γ和抗炎性的Th2及其细胞因子IL-4的不平衡被认为在自身免疫病的发病机制中有重要的作用 ［6］ 。Moller等 ［7］ 发现RA滑膜和外周血的T细胞在PMA/离子霉素刺激后产生细胞因子以IFN-γ为主，IL-10也有大量表 达，滑液中的CD4+细胞产生的IL-10比外周血中的多。杨宇等 ［8］ 也发现RA患者活动期的CD4+细胞和CD4+/CD4-比值较非活动期升高，CD8+细胞活动期较非活动期降低，提示RA患者细胞免疫参与了RA的发病过程，可见疾病的发展变化与RA患者外周血T细胞亚群的变化直接相关。本实验采用流式细胞双标技术在单细胞水平上检测RA患者PBMC的T细胞亚群，结果表明，RA患者PBMC及正常人PBMC经刺激培养后，细胞因子的分泌模式出现显著差异，RA患者PBMC中的IFN-γ + 细胞和IFN-γ + /IL-4 + 细胞百分率高于正常人，而IL-4 + 细胞百分率与正常人无明显差异。活动期RA患者PBMC中的IFN-γ + 和IFN-γ + /IL-4 + 细胞百分率明显高于非活动期RA患者，而IL-4 + 细胞百分率明显低于RA患者非活动期。从以上结果可以看出RA患者PBMC中的细胞因子模式明显向Th1方向偏移，说明Th1细胞及其分泌的细胞因子占优势，与一些学者推测的“Th1漂移（Th1shift）学说”相符合 ［9］ ，提示RA为器官特异性的自身免疫。
本实验采用流式细胞仪双标技术快速、精确的检测RA患者外周血Th1/Th2细胞内细胞因子，对RA患者病情的检测、疗效观察起重要作用，有报道，通过细胞因子受体拮抗剂直接连接到高亲和力的细胞因子表面受体来抑制某些细胞因子的作用，为类风湿性关节炎的防治和改善预后开辟了一条新途径。
参考文献
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作者单位:518116广东省深圳市龙岗中心医院