肺炎衣原体抗体的制备及应用

    【摘要】 目的  肺炎衣原体抗体（Cpn-PcAb）的制备及应用。 方法  用10μl Cpn菌株TW-183（2×10 8 ifu）与300μl福氏完全佐剂混匀后皮下多点注射新西兰白兔。双向琼脂扩散法鉴定血清抗体的效价为1∶64，用硫酸铵盐析法、DEAE-Sephadex-50层析法纯化免疫球蛋白（IgG），然后用异硫氰酸荧光素（FITG）标记IgG。用Cpn-PcAb与美国进口Cpn-单抗（Cpn-McAb）同时检测病人外周血标本294例。另外，分别从Cpn-PcAb检测出Cpn特异性抗原阳性的外周血单核细胞（PBMC）标本（A组）中和对照组（B组）中随机各挑选20例，用PCR检测PBMC中的Cpn-DNA。 结果  Cpn-PcAb检测的阳性率为45.9%（135/294），Cpn-McAb检测的阳性率为43.5%（128/294），两种抗体同时阳性的标本有110例，Kappa值是0.7，根据其判断标准提示两者有较高的一致性。A、B两组Cpn-DNA阳性标本分别为17例和3例。 结论  Cpn抗体几乎和Cpn单抗一样有较高的特异性和敏感性，可能可以替代进口单抗用于临床Cpn感染的检测，有助于相关疾病的诊治。
      
　　【关键词】  肺炎衣原体多克隆抗体 肺炎衣原体单克隆抗体 微量免疫荧光 外周血单核细胞
     
　　Production and application of polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae
     
　　Wang Weiqun，Zhang Ruihua，Yu Zhuyuan.
   
　　Department of Cardiology，Jinshan Hospital，Fudan University，Shanghai200540.
   
　　【Abstract】 Objective Production and application of polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae（Cpn）.Methods The New Zealand white rabbit was subcutaneously injected with10μl Cpn strain TW-183（2×10 8 ifu）and300μl complete Freund adjuvant.The serum antibody titer of1∶64was identified by two dimensional immunodiffu-sion test.IgG was extracted from serum and purified by ammonium sulphate salting out and DEAE-Sephadex A-50chromatography，then was labeled by fluorescein isothiacyanate.In order to evalute Cpn-PcAb，the blood specimens of294patients were deected by Cpn-PcAb and Cpn monoclonal antibody（Cpn-PcAb）fromUSA at the same time.On the other hand，we randomly selected20peripheral blood mononuclear cell（PBMC）specimens with Cpn antigen posi-tive（group A）and20ones with Cpn antigen negative（group B）by Cpn-PcAb detection，then detected Cpn-DNA in PBMC by PCR.Results The positive rate was45.9%（135/294）for Cpn-PcAb and43.5%（128/294）for Cpn-McAb，and110cases have the same positive for them，showing the high concordance between them（Kappa=0.7）.The specimens of positive Cpn-DNA were in17and3respectively between group A and group B.Conclusion The Cpn-PcAb has almost the same high specificity and sensitivity as Cpn-McAb.The Cpn-PcAb may be replace Cpn-McAb to detect the Cpn specific antigen and be helpful to diagnose and treat the clinical diseases associated with Cpn infection.
     
　　【Key words】 polyclonal antibody to chlamydia pneumoniae（Cpn-PcAb） monoclonal antibody to Cpn（Cpn-McAb） micro-immunofluorescence peripheral blood mononuclear cell
      
　　肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，Cpn）是嗜衣原体（Chlamydohila pneumoniae）属下的一个种，是一种常见的呼吸道病原体，带菌者和隐性感染者非常普遍 ［1，2］ 。近年来在多种系统疾病患者血清中检出的Cpn-抗体均显著高于相应对照组 ［3］ ，如心血管系统、呼吸系统、血液系统疾病等，因此Cpn已成为危害人类健康的一种病原体，尤其是它在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）形成过程中的作用日益受到国内外学者广泛关注。Cpn感染和AS之间的关系已为血清流行病学、病理学和分子生物学等实验技术所证实 ［4］ 。笔者亦建立了外周血单个核细胞中Cpn-抗原的检测方法 ［5］ ，并用于临床检测，为临床相关疾病的诊治提供可靠依据。但是，目前检测Cpn-抗原所用的单抗主要依赖进口，为此笔者尝试用家兔自制抗Cpn抗体，并已获得成功，现将结果报道如下。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 兔抗肺炎衣原体抗体的制备 用10μl Cpn菌株TW-183（2×10 8 ifu）与300μl福氏完全佐剂混匀后皮下多点注射新西兰白兔（New Zealand white，NZW），在第14、28和42天，用10μl Cpn菌株与300μl福氏不完全佐剂混匀后皮下多点注射NZW，用双向琼脂扩散法鉴定其抗血清效价>（1∶64）后，颈动脉插管放血55ml，分离出血清25ml，用硫酸铵盐析法、DEAE-Sephadex-50层析法逐步纯化兔免疫球蛋白（IgG），用考马氏亮蓝法测其蛋白含量为3.45mg/ml。
   
　　1.2 肺炎衣原体抗体荧光素结合物的制备 将纯化的IgG抗体用pH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，配制异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiacyanate，FITC）二甲亚砜（DMSO）溶液，使终浓度为1mg FITC/1ml DMSO。按50μg FITC/1mg IgG比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中。标记物用pH9～9.5碳酸盐缓冲液加至2.5ml，再将其装入透析袋，并放在预冷4℃的碳酸盐缓冲液中，于4℃暗处磁力搅拌过夜。然后用PBS于4℃暗处透析5次，以除去游离的FITC，直至透析外液与参比溶液PBS在495nm处吸光度一样。FITC标记物分别在276nm和493nm测定光密度，然后根据计算图算出荧光素（F）与蛋白（P）mol比值，合适的F/P比值为2～4。
   
　　1.3 Cpn-PcAb与Cpn-McAb同时检测标本 复旦大学附属金山医院住院患者共294例，其中冠心病、高血压、心肌梗死、糖尿病等患者109例，肺炎、支气管炎、哮喘、肺气肿等患者135例，慢性鼻炎、鼻息肉、鼻窦炎、咽喉炎、扁桃体炎等患者50例。常规无菌采集静脉血3ml，EDTA抗凝。外周血单核细胞（PBMC）分离参照Moazed等 ［6］ 方法略加修改:抗凝血2000rpm离心5min，吸出血浆后的余血用等体积PBS稀释混匀，再缓慢加到含有3ml淋巴细胞分离液试管中，然后于室温2200rpm离心30min，吸出含有PBMC的中间云雾状层，用PBS洗至不含红细胞后，悬浮于PBS中，使其约含PBMC5×10 6 个。PBMC中Cpn-抗原的检测参照Timms等 ［7］ 方法略加改进:吸取新鲜制备的PBMC悬浮液10μl（约含PBMC6×10 5 个）分别在载玻片上涂出2个直径4～5mm的圆点，电吹风吹干后丙酮固定3次。其中一个圆点作为空白对照，另一个圆点加上5μl Cpn-McAb（FITC-TT-401）稀释液（工作浓度1∶40，即5μl FITC-TT-401原液+195μl0.01%伊文氏蓝PBS），置湿盒于37℃温育1h，PBS洗3次，每次3min，再用蒸馏水洗3次，电吹风吹干。同时用自制FITC-Cpn-PcAb进行平行操作。然后将载玻片置荧光显微镜下（HB0200汞灯，第一滤片:BG-12，第二滤片:CG-13和WILD8075）由2人观察并核对大小均匀的特征性苹果绿亮点。测定圆点内的荧光亮点数减去空白圆点内的荧光亮点数后的差数，作为特异性抗原阳性的依据。阳性对照:Cpn菌株（TW-185）牛奶稀释液作为抗原，以PBS为阴性对照。抗原阳性判断标准参照Muhlestain等 ［8］的标准:强阳性（>100个亮点/原点），阳性（10～100个亮点/原点），阴性（<10个亮点/原点）。
   
　　1.4 PCR法检测外周血单核细胞中Cpn-DNA 按笔者已发表的方法进行 ［9］ 。1.5%凝胶于5V/cm下电泳1h，在紫外灯下观察结果，PCR扩增产物为474bp。

　　1.5 统计学处理
   
　　1.5.1 采用χ 2 检测法 P<0.05为差异有显著性。
   
　　1.5.2 采用Kappa值判断两种方法的一致性强度 Kappa值在0.61～0.80，一致性强度属于高度。

　　2 结果
    
　　2.1 Cpn抗体效价和交叉反应鉴定 应用进口可溶性Cpn-脂多糖（LPS）来鉴定，琼脂糖双向免疫扩散结果表明，Cpn抗体效价为1∶64。Cpn抗体与沙眼衣原体-LPS抗原无交叉反应。
   
　　2.2 Cpn抗体与进口单抗同时检测PBMC中Cpn-抗原 294例PBMC标本中Cpn-McAb检出Cpn特异性抗原阳性128例，阴性166例;而Cpn-PcAb检出的阳性标本135例，阴性159例，二者之间差异无显著性（P>0.05），见表1。
   
　　2.3 Cpn-PcAb检测PBMC中Cpn-抗原方法评估 Cpn -PcAb与Cpn-McAb同时检出PBMC中Cpn-抗原阳性的标本有110例，而PBMC中Cpn-抗原阴性的标本为141例，Kappa值是0.7，根据其判断标准表明:Cpn-PcAb与Cpn-McAb检测结果的一致性强度属于高度，见表2。
    
　　表1 Cpn抗体与进口单抗检测PBMC中Cpn-抗原的结果比较 （略）
   
　　表2 Cpn抗体检测PBMC中Cpn-抗原方法评价 （略）
    
　　2.4 PCR法检测外PBMC中Cpn-DNA结果 20例用Cpn-PcAb经直接微量免疫荧光（DI）法检测出Cpn-抗原阳性的PBMC标本中，用PCR法从17例PBMC中检测到Cpn-DNA;20例用Cpn-PcAb经DI法检测Cpn-抗原阴性的PBMC标本中，用PCR法从3例PBMC中检测到Cpn-DNA。可见自制Cpn-PcAb有较好的敏感性和特异性，见表3。

　　表3 PCR法和DI法检测PBMC结果比较 （略）
   
　　3 讨论
    
　　近年来根据流行病调查，发现多种系统疾病都与Cpn感染有关。国外已成功分离出Cpn菌株-183、AR-39、AR-59、AR-458、LR-65等，而且有Cpn活菌和单抗出售，并用阿齐霉素进行较大规模的临床干预试验 ［10］ 。国内有学者就冠心病患者做了有关Cpn感染的流行病学调查 ［11］ ，建立了家兔Cpn感染和动脉粥样硬化模型［9］ 。目前，临床诊断Cpn感染的依据主要依靠抗体的检测，但是Cpn抗体的检出只能说明该个体感染过Cpn，却不能反映体内是否仍有Cpn活菌存在。而Cpn特异性抗原的检测能直接反映该个体内有无Cpn活菌的存在 ［12］ ，为此笔者已建立了PBMC中Cpn-抗原的检测方法 ［5］ ，并用于临床检测，为临床相关疾病的诊治提供可靠依据。但检测Cpn-抗原所用的Cpn单抗目前尚依赖进口，不仅手续麻烦，且价格昂贵。为此，我们采用Cpn菌株感染新西兰白兔，成功地获得纯度较高的家兔抗Cpn-抗体。为了测定其特异性和敏感性，我们用进口单抗（FITC-TT-401）与自制的FITC-Cpn）抗体同时检测294例PBMC中Cpn特异性抗原，阳性标本分别为128例和135例（见表1），同时都为阳性的有110例，同时都为阴性的有141例，Kappa值为0.7（见表2），根据Kappa值判断标准提示自制的Cpn抗体与进口单抗的检测结果具有较好的一致性。
   
　　另外，我们随机挑选了20例用Cpn抗体经DI法检测Cpn特异性抗原阳性和20例阴性的PBMC标本，用PCR法检测Cpn-DNA。结果显示阳性组有17例，阴性组有3例检测到Cpn-DNA（见表3）。由此表明，自制的Cpn抗体特异性较好、敏感性较高，可能可以替代进口单抗用于临床Cpn-抗原的检测，有助于Cpn感染相关疾病的诊治，而且为进一步制备Cpn单克隆抗体提供了经验。
    
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　　作者单位:200540上海复旦大学附属金山医院心内科